木本果树组织培养主要难点及对策分析

罗一然 李雄军

（大理农林职业技术学院，云南大理 671003）

植物的组织培养技术发源于20世纪，经过100年的发展，已经成为生物技术的基础，不仅运用于科学领域，也广泛运用于农业、林业的生产实践。组织培养技术在草本植物特别是花卉种苗繁殖生产中已经得到广泛运用，但木本植物理化性质复杂，组织培养的难度更大且需要更多的时间摸索，即便培养成功，在推广应用时也要考虑生产成本，从而导致产业化应用难度大。目前，木本植物组织培养过程中往往伴随着灭菌难、褐化、生根难等问题，且大多木本植物组培技术之间还未找到可普遍遵循的规律[1]。随着木本果树需求量的迅速增加，其组织培养和快速繁育技术研究越来越受重视。现代生物技术还能以组织培养为基础，结合细胞融合及基因工程技术对优良树种进行转基因[2]。因此，有必要对木本果树植物组织培养中存在的难点进行概括和分析，为木本果树植物组织培养研究提供理论参考。

1 外植体消毒

1.1 外植体选择

木本植物选择合适的外植体进行组织培养可以有效的控制污染。选择幼嫩、木质化较低的茎段、腋芽或者在种子外皮包裹下的胚、子叶等材料作为外植体进行培养，可以提高组织培养脱毒的机率。冯金玲等[3]以锥栗的胚、腋芽、韧皮部、叶子和茎段作为外植体，研究不同外植体和消毒方法对组织培养的影响，结果表明，胚为污染率最低且成活率最高的外植体。汪灵丹等[4]比较了大叶榉的顶芽、腋芽、茎段、叶片等外植体，得出在每年3月采集的顶芽是理想的外植体，能获得比较好的消毒效果且萌芽率在95%以上，选择适宜植物生长的季节以及晴朗干燥的日子，可以减少污染。陈泽雄和娄娟[5]在酷热干燥的盛夏午后以半木质化的柑桔带芽茎段为外植体，显著降低了污染率，最终将污染率控制在10%之内。

1.2 木本植物外植体消毒方式

对于大多数草本植物来说，只需进行表面消毒即可，通过试验筛选出一个合适的消毒时间就能达到较好的灭菌效果。而木本植物本身携带许多内生菌，加之外植体材料木质化，在表面消毒的同时往往还需要进行其他处理。常用于植物组织培养的消毒剂有许多（表1），针对不同植物不同部位的外植体，选择一种恰当的消毒方法，才能达到灭菌效果。

表1 不同消毒剂效果比较

木本植物外植体携带的内生菌往往比表面细菌更多且更复杂，仅仅使用一种消毒剂消毒难以达到灭菌效果。所以木本植物消毒时，要采用消毒剂组合的方式来消毒，常见的组合消毒方式为酒精+升汞、酒精+次氯酸钠。张学英等[6]在研究白桦组织培养时，先将外植体冲洗20 min，然后在超净工作台上，用75%酒精浸泡30 s，再用0.15%的升汞浸泡10 min，无菌水冲洗5次，达到了较为理想的消毒效果。陈雪莲等[7]对黄连木茎段进行消毒时，采用70%乙醇灭菌5 s，再用0.1%的氯化汞灭菌8～12 min，效果最好，污染率和褐变率都最低。但有些木本植物的外植体，使用组合消毒剂消毒也很难根除细菌，如酚类分泌量比较大的漆树、阿月浑子等。针对这一类植物外植体，消毒前要增加一步结合消毒剂的冲洗操作，以漆树为例，用加入洁尔灭的流水冲洗2 h，再进行组合式消毒，可以取得较好的杀菌效果。

2 褐化的发生与抑制措施

2.1 外植体选择

与草本植物相比，木本植物更容易发生褐变，因为它们木质素和单宁含量较高，这两种物质是酚类糖苷化合物合成的前体，在离体培养过程中容易发生褐变。鞠志国[8]对果实成分进行提取检测，发现果实内总酚含量与褐变有直接关系。陈正华[9]在以多种基因型的香蕉花药为对象培养时观察到，木质化低的欧洲栗外植材料褐变较轻，木质化较高的外植体褐变现象较为普遍且较重，其内部酚类物质随外植体的木质化程度升高而增加。如1月的欧洲栗芽较幼嫩，培养时酚类物质形成少，5-6月份，芽逐渐木质化，酚类物质增多。由此可见，外植体材料的基因型或者材料的年龄差异，导致褐变水平也有很大差异。

2.2 合理选择抑制剂

在培养基制作过程中混合一定量的抗氧化剂和其他抑制剂，可有效减轻外植体在离体培养中的褐化程度。维生素C的还原性还可以使多酚氧化酶失活，阻碍酚类物质进行氧化反应。黄霞等[10]发现香蕉茎尖培养时，在培养基中加入适量活性炭与维生素C，可有效防止外植体的褐变，这是因为维生素C在酶的催化下会吸收掉培养基中的部分氧，使酚类有害物质因缺氧减弱氧化。另外，水解酪蛋白、PVP、半胱氨酸、硫脲、氰化钾、部分氨基酸等物质都可作为抑制剂来控制褐变率[11]。

活性炭(AC)是一种高效的天然吸附剂，可以有效吸附植物分泌到培养基中的酚、醌等促褐变物质，从而提高外植体成活率[12]。但其吸附能力强，在吸附有害成份的同时也会吸附培养基中的外源激素和营养成份，使培养基效力降低，影响外植体的正常发育。因此，活性炭的用量要适度，同时调整激素配比，在防止褐变的同时，确保外植体正常发育。

2.3 其他抑制褐变方式

对于易褐变的外植体材料，可以在组培时持续进行转瓶操作，改变外植体与培养基的接触面，或者更换新的培养基来消弱酚类物质的毒害。所以定期地将外植体转移一次新培养基，是一种有效抑制褐变的手段。

对外植体材料预处理也可以有效减轻醌类物质对培养物的毒害作用。许多外植体经过低温处理后再接入培养基，可以有效降低褐化率。也可以使用液体培养基对外植体进行悬浮培养，待组织中的酚类物质部分渗入培养液中后，再将外植体取出，接入到固体培养基中，也能有效抑制褐化现象[13]。

通过总结前人研究经验，可以把组织培养褐变归结为是酚类物质被氧化的结果。褐变的引发是由多种因素协同作用影响的，从外植体材料内部来看，其生理状态、基因型、培养条件、营养状况和年龄均会影响褐变的产生，培养基成分、外源激素含量及比例、培育环境条件等也会影响褐变的产生，所以褐变并不是单纯由某个因素促成，它的发生需要考虑多个环节，从关键环节阻断褐变源，才是控制褐变的有效手段。

3 木本植物生根诱导

木本植物再生植株生根较困难[9]，生根问题仍然是目前组织培养完整体系建立和高效快繁的瓶颈。为解决木本植物生根困难的问题，目前国内外学者均对不同植物开展了大量的研究工作。

3.1 合理的激素配比

适当的外源激素能够促进生根，主要的作用机理是能有效刺激细胞分裂，打破细胞休眠，加快分裂进程。NAA与IBA常被用在植物组织培养的生根环节，裴东等[14]以几种不同基因型的核桃嫩茎为外植体进行生根诱导研究，在培养基中加入适量浓度的IBA，显著提高了组培苗的生根率。董社琴等[15]以紫龙角的不同器官为外植体材料，添加不同浓度的NAA，筛选出了最佳生根培养基1/2MS + NAA 2.5 mg/L。郝爱丽等[16]在对青榨槭组培时发现，培养基中加入适量NAA、IBA和GA3后均能提高青榨槭的生根效率，并且获得根系发达的完整植株。

3.2 微嫁接

微嫁接是一种建立在组织培养基础上的嫁接技术，在试管内将砧木与接穗进行嫁接，主要针对目前生根难的木本植物品种。先以实生种子培养砧木，通过微嫁接的方式，嫁接组培苗，最后获得微嫁接苗，提高成活率。在苹果上，先利用种子在培养基上生根发芽，然后切去主芽，保留根段作为砧木，将较难生根的苹果品种组培苗嫁接于该根段上，克服了生根难、成活率低的难题[9]。同样的技术在柑橘组培研究中也有类似文献报道[17]。

3.3 光照强度对生根的影响

谢耀坚[18]发现桉树愈伤组织在光照周期为12 h/d条件下，容易诱导出不定根，在无光照条件下却不能诱导出根系。而James[19]等人则认为，暗培养是部分木本植物不定根发生的前提，避光培养不仅可以改善根系弱小的问题，也能促使植株长出更多须根、侧根，这大概与暗培养使得植株的内部生理状态的发生改变有关。

3.4 合理的基本培养基选择

合理的培养基选择，是促进木本植物生根的关键，除了基本营养元素的添加外，还应该注意培养基的物理性质。国外学者Chaum[20]将澳洲坚果不定芽接入以蛭石代替琼脂为基质的MS培养基中诱导生根，这种培养基通气性良好，成功诱导出了生根苗。

在组织培养生根时，一般使用1/2甚至1/4无机盐浓度的培养基，姚瑞玲等[21]在对松树进行不定根诱导时以1/2量的WPM、改良的MS和DCR等不同基本培养基开展试验，最后筛选出1/2改良的MS培养基作为试验的生根培养基。尹丽莎等[22]发现北美红杉组培苗生根诱导时，不同量的MS培养基生根率从高到低依次为：1/4MS＞1/2MS＞MS，而且1/4MS培养基中北美红杉根系发达且生长良好。

在土壤中低磷素环境下，山龙眼科植物的根系为了增加磷素吸收而伸长发育。杜建斌[23]在对山龙眼科植物根发育生理效应研究中发现，在高磷土壤中，山龙眼根很少发育。笔者在对山龙眼科植物澳洲坚果进行组织培养时，曾选用更适合木本植物的组织培养的WPM培养基，但其磷素水平与MS培养基一样（170 mg/L），生根效果不佳，后改用1/2MS培养基，获得了良好的生根效果，这也验证了前人的结论。在诱导木本植物组培苗生根时，要从植物生理因素、培养基理化因素等多个方面进行分析，在综合条件共同作用下诱导生根是解决问题的关键。

4 结语

当前木本果树植物组织培养研究工作的重点是建立起和草本果树植物一样高效的再生体系，这样更有利于全面研究木本植物植株离体再生机制，深入了解植物的遗传变异。同时还要摸索更多木本植物再生的其他方式，多角度分析影响木本植物组织培养的问题，灵活寻找解决办法。笔者相信，合理利用各种科学技术，发挥组织培养优点，木本植物组织培养实现工厂化繁育只是时间问题。