单一及混合乳酸菌发酵对番木瓜汁品质的影响

周 瑶 李 娟 贾凤霞 黄婧禹 苏智敏 陈 岗

(重庆市中药研究院,重庆 400065)

发酵不仅能延长食品保质期,还可以增强食品的感官特性,增加生物利用度和改善食品的营养价值等。例如,植物乳杆菌发酵提高了番石榴果提取物的植物化学和理化特性[1]。乳酸菌发酵的一个重要方面是利用碳水化合物、蛋白质、微量元素、矿物质及次生代谢产物多酚等进行代谢,产生有机酸、糖、芳香族化合物及新的功能成分[2]。

番木瓜(CaricapapayaL.)自17世纪传入中国后在中国各省被广泛栽培。成熟的番木瓜果实除富含碳水化合物(6.50%～9.51%)外[3],还含有其他多种营养元素,包括蛋白质(0.40%～1.17%)、胡萝卜素(约1 mg/100 g)、维生素C(40～60 mg/100 g)和维生素A(18.50～56.50 mg/100 g)等。有研究[4-5]表明,根据品种和成熟度的不同,吃半个木瓜(100 g)就能提供普通成年人所需维生素A的2%～10%,而维生素A对人体非常有益,不仅具有抗氧化特性,还能通过视黄醇结合蛋白信号传导调节胰岛素敏感性和维持脂肪的稳态。此外,野生木瓜果肉中总酚含量为9.16 μmol没食子酸当量/g果肉,与番荔枝科的其他水果相当,包括番荔枝、石榴、蔓越莓等。木瓜中还富含原花青素(浓缩单宁),为一种极好的健康抗氧化剂[6]。此外,番木瓜还具有多种生理功能,包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等特性。特别是在降糖方面,口服木瓜叶提取物可显著降低糖尿病大鼠的血糖水平、转氨酶和甘油三酯[7]。还有一种已商品化的木瓜制剂,证明其可以改善糖尿病前期和糖尿病患者血小板[8]。

番木瓜有不愉快气味,且是一种极易腐烂的水果,不易保存[9-10]。而通过乳酸菌发酵处理不仅能延长其保质期还能改善其风味。目前,大多数乳酸菌的研究仅限于单菌或混合菌对某种基质的独立研究,对同一种基质的单菌和混合菌在同一条件下的对比研究较少。虽然有充分的证据表明益生菌混合物对多种疾病有有益作用,然而混合物比其组成菌种更有效的证据较为有限。此外,在一个证明益生菌混合物更有效的12项研究中,有4项研究表明混合物不是更有效的,说明混合物比单独使用的成分菌种更有效或更不有效,取决于不同的菌种[11]。

研究拟探讨3种不同的乳酸菌(植物乳杆菌、鼠李糖杆菌和嗜酸乳杆菌)单菌和两两混合菌对番木瓜汁发酵后植物化学、微生物学和风味特性的影响,并分析番木瓜汁总酚、总黄酮成分与降血糖和抗黑色素的相关性,以期为寻找合适的发酵剂,开发出一种具有改善功能和促进健康特性的番木瓜益生菌发酵饮料提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

番木瓜:别名红心冰糖牛奶木瓜,甜度比一般的番木瓜高,选用单果在500 g左右,果肉饱满成熟,无病虫害,采自云南西双版纳;

植物总酚测试盒、植物类黄酮测试盒、α-葡萄糖苷酶测试盒:苏州科铭生物技术有限公司;

酪氨酸酶活性检测试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;

甲醇:色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司;

其他试剂均为国产分析纯;

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus):广州汇健生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

洁净工作台:ZHJH-C1118C型,上海智城分析仪器制造有限公司;

立式压力蒸汽灭菌器:LDZM-80KCS型,上海申安医疗器械厂;

电热恒温培养箱:DHP-9162B型,上海一恒科学仪器有限公司;

高效液相色谱仪:LC-20A-DAD型,日本岛津公司;

三重四极杆气相色谱—质谱联用仪:TSQ8000EVO型,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

全自动酶标仪:P-800型,杭州遂真生物技术有限公司;

台式高速冷冻离心机:3-18KS型,德国西格玛离心机公司;

紫外可见分光光度计:752型,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;

pH计:PHS-25型,上海仪电科学仪器股份有限公司;

阿贝折光仪:WAY-2W型,上海仪电物理光学仪器有限公司;

超低温冰箱:DW-86L390型,澳柯玛股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番木瓜汁发酵果汁的制备 选择新鲜无腐烂、成熟度合适的番木瓜,清洗,去皮去籽,切块打浆后得到木瓜原浆,加入1倍质量的蒸馏水,65 ℃杀菌30 min,于洁净工作台按106CFU/mL接种量分别接种植物乳杆菌(Lp)、鼠李糖杆菌(Lr)、嗜酸乳杆菌(La)以及3种乳杆菌按1∶1两两复配的菌悬液:植物乳杆菌+鼠李糖杆菌(Lp+ Lr),植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌(Lp+ La),鼠李糖杆菌+嗜酸乳杆菌(Lr+La),37 ℃恒温培养72 h。未发酵和发酵样品经过滤后,滤液于-80 ℃冷冻备用。

1.2.2 理化指标测定

(1) pH值:采用pH计法。

(2) 可溶性固形物含量:参照NY/T 2637—2014。

(3) 总酸:参照GB/T 12456—2008。

(4) 活菌数:参照GB 4789.35—2010。

1.2.3 总酚、总黄酮含量测定 通过植物总酚测试盒、植物类黄酮测试盒测定。

1.2.4 有机酸含量测定 参照GB 5009.157—2016。

1.2.5 单糖含量测定 参照GB 5009.8—2016。

1.2.6α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性测定 通过α-葡萄糖苷酶测试盒和酪氨酸酶活性检测试剂盒测定。

1.2.7 挥发性物质测定 根据Gomes等[12]的方法适当修改,采用三重四极杆气相色谱—质谱联用仪测定番木瓜汁中挥发性物质,色谱柱为Supelcowax(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。色谱条件:进样温度200 ℃;不分流模式;升温程序为以2 ℃/min从50 ℃升至150 ℃,保持5 min;载气(He)流速1 mL/min。质谱条件: EI源;电子能量70 eV;传输线温度250 ℃;离子源温度 230 ℃;扫描方式为全扫描;质量范围(m/z)为20～350。

2 结果与分析

2.1 番木瓜汁发酵过程中理化性质的变化

由表1可知,木瓜汁发酵72 h后,各组可溶性固形物含量均从9.5 °Brix降至8.0～8.5 °Brix。木瓜果实的pH值为5左右,符合3种乳酸菌生长的最适pH值,发酵72 h后,各组pH值均降低为3.3左右。各组可滴定酸含量均显著增加。

表1 番木瓜汁发酵过程中理化性质的变化†

单菌发酵中,虽然3种乳酸菌以相似的细胞数[6.00 lg(CFU/mL)]接种,但发酵72 h后,Lr活菌数最高为7.52 lg(CFU/mL);La最低为7.26 lg(CFU/mL),与Malik等[12]的结果类似,其活菌数下降的最可能原因是果汁酸度迅速增加。混合菌发酵组中,Lp+Lr的活菌数最高为7.61 lg(CFU/mL),同时也是所有发酵组中(单菌和混菌)活菌数最高的组,而Lp+La的最低[7.00 lg(CFU/mL)]。综上,单一菌种也可以满足番木瓜的发酵要求。同时,混合发酵组中的活菌数与菌种的相互作用有很大关系。即使是同一种发酵剂,由于菌种产酸能力、耐酸能力、营养物质竞争等,可能导致比单一菌种好或不好的发酵效果[13]。

2.2 番木瓜汁发酵后糖类的变化

由表2可知,发酵和未发酵的木瓜汁中均未检出蔗糖,可能是其值低于仪器检出限而未被检出,由此说明木瓜为蔗糖含量少的低热量水果,与于璐等[14]的结果一致。单一菌种发酵中,3种乳酸菌均能消耗葡萄糖,其中植物乳杆菌的消耗能力最强。所有菌对果糖的消耗能力均低于葡萄糖的,特别是嗜酸乳杆菌几乎未消耗果糖。混合菌发酵中也有类似结果,各组主要以消耗葡萄糖为主。据报道[15],嗜酸乳杆菌在单糖中只能利用葡萄糖作碳源。

表2 番木瓜汁发酵72 h后糖类的变化†

植物乳杆菌则能够同时代谢两种糖类,且在葡萄糖存在的情况下,果糖是其第二优选单糖[16]。半乳糖和葡萄糖被证明是鼠李糖最有效的碳源[17]。综上,番木瓜汁经植物乳杆菌单菌发酵后可能会产生更佳的风味。

2.3 番木瓜汁发酵后有机酸含量的变化

由表3可知,番木瓜原汁中5种有机酸含量差异较大,其中柠檬酸含量最高为3.47 g/L;苹果酸含量次之,为2.98 g/L。番木瓜汁经各种乳酸菌发酵后,有机酸组成发生了显著而不同的变化。发酵72 h后,乳酸和琥珀酸含量显著增加,柠檬酸和苹果酸含量显著降低,酒石酸含量变化不大。其中,乳酸是番木瓜汁发酵后形成的主要有机酸,Lp在所有发酵组中产生乳酸量最高为14.41 g/L,Lr+La产量较低(10.89 g/L),其他发酵组结果相近。Chen等[18]研究发现,经嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵后,番木瓜汁中乳酸含量分别为5.43,5.71 g/kg。事实上,大多数乳杆菌可以通过一种苹果乳酸酶将苹果酸脱羧直接转化为乳酸,还可以代谢柠檬酸产生乳酸、二乙酰基、乙酰丙酮和乙酸[19]。Mousavi等[16]发现植物乳杆菌能够利用苹果酸作为碳源,且苹果酸的代谢与糖代谢同时开始。因此,各组柠檬酸和苹果酸含量在发酵后均显著降低,而乳酸含量则显著增加。李维妮等[20]研究表明,乳酸菌能够利用三羧酸循环产生的柠檬酸合成琥珀酸,故发酵后琥珀酸含量增加,而适当含量的琥珀酸有利于产品的口感,但由于其具有苦咸味,过量则可能会造成不利的口感,直接影响果汁的酸味。

表3 发酵72 h后番木瓜汁的有机酸含量变化†

综上,单菌种发酵和混合菌种发酵番木瓜汁过程中,5种有机酸的代谢变化情况具有相似性。特别注意的是,单菌种Lp在产乳酸上更具有优势性,很大程度上可能归功于植物乳杆菌具有较强的产酸和利用碳水化合物的能力。因为Lp属于同型发酵类型中的兼性异型发酵群,具有全面的糖代谢,有很强的发酵碳水化合物的能力,主要产生乳酸和少量乙酸[21-22]。而La只有糖酵解途径,表现为同型乳酸发酵,只生成乳酸[23-24]。此外,叶盼[25]通过6种乳酸菌发酵苹果汁证实了Lp具有较强的产酸能力(植物乳杆菌>瑞士乳杆菌>戊糖片球菌>副干酪乳杆菌>明串珠球菌>嗜酸乳杆菌)。

2.4 番木瓜汁发酵后总酚、总黄酮含量和部分功能特性的变化

2.4.1 总酚、总黄酮含量 由表4可知,发酵明显提高了样品的总酚和总黄酮含量。发酵组的总酚和总黄酮含量分别为1.17～2.93,0.81～1.38 mg/g干基,显著高于未发酵组(1.15,0.52 mg/g干基)。与其他乳酸菌相比,Lp也使得果汁中具有更高的总酚和总黄酮含量,可能与乳酸菌合成水解酶的能力有关。此外,乳酸发酵果汁中多酚含量较高也可能是聚合物降解的结果,聚合物的降解是将复杂化合物转化为自由形式,由酚氧化酶调节,而酚氧化酶的合成则依赖于乳酸菌。研究[26]表明,植物乳杆菌在代谢多酚方面表现出很高的酶活性,在乳杆菌属的所有物种中,负责合成酚脱羧酶和单宁酶的基因只有植物乳杆菌所特有,被认为具有最高的多酚代谢能力。Wang等[27]利用嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖杆菌发酵蓝莓汁,所有发酵组的总酚含量分别提高了20.49%,37.6%,12.46%,总黄酮含量分别提高了20.3%,37.5%,16.0%。

表4 发酵72 h后番木瓜汁总酚和总黄酮含量的变化†

2.4.2 功能特性变化 由图1可知,番木瓜汁对α-葡萄糖苷酶的抑制率为10.47%。发酵后α-葡萄糖苷酶抑制率显著提高,Lp、Lr,、La的分别为48.48%,36.55%,43.46%。Lp+Lr、Lp+La、Lr+La发酵番木瓜汁后,α-葡萄糖苷酶抑制率分别为39.86%,44.39%,39.47%。总体来看,Lp单菌发酵后,α-葡萄糖苷酶的抑制作用略强,归因于酚酸和黄酮类活性物质的增加。多酚可以通过疏水相互作用与α-葡萄糖苷酶的活性位点结合,竞争性抑制这些酶的催化活性。Ankolekar等[28]研究表明,各品种总酚含量与α-葡萄糖苷酶含量呈负相关(r=-0.79～-0.99)。也有研究[29]表明,α-葡萄糖苷酶抑制活性与总黄酮含量显著相关。由表5可知,α-葡萄糖苷酶抑制率与总酚、总黄酮含量具有显著正相关性,相关性分别为0.837和0.844。高鹤[30]研究表明,发酵过程中,植物乳杆菌分泌的酶可以通过水解苦瓜中皂甙的糖苷键释放苷元和多酚类物质,达到抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。不同乳酸菌对α-葡萄糖苷酶抑制能力的差异,可能是由于不同菌种对酚类物质的代谢不同所致[27]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

表5 发酵番木瓜汁的功能特性和主要活性成分的相关系数†

酪氨酸酶是黑色素合成反应的限速酶,其异常表达过量和催化活性升高会引起黑色素生成过多,从而引发黄褐斑、老年斑等色素性疾病。由图2可知,各发酵番木瓜汁中酪氨酸酶抑制活性均显著增加,且单菌发酵组的抑制性比混合菌发酵组的更强。由表5可知,酪氨酸酶抑制率与总酚含量呈显著正相关(r=0.847),但与总黄酮含量无显著相关性。田丝竹等[31]研究发现,酚酸提取物对酪氨酸酶具有较高的抑制能力,该抑制能力与总酚含量高度相关(r=0.879)。Lizardo等[32]研究表明,副干酪乳杆菌单菌发酵对酪氨酸酶抑制活性比植物乳杆菌单菌及两者混菌发酵的更强。

综上,乳酸菌发酵的活性成分和功能特性可能与多酚之间存在深层次的双向关联,酚类化合物含量与乳酸菌的代谢直接相关。而酚类化合物可以影响乳酸菌的生长和代谢[19]。相比混合菌发酵,单一菌可能更可取,混合菌的优势主要取决于菌种的相互作用。因此,正确选择发酵基质和相应的乳酸菌有可能生产出具有高功能性食品的潜力。

2.5 番木瓜汁发酵后挥发性成分的变化

Pino等[33]研究表明,番木瓜中主要挥发性成分以酯类为主(约占总挥发物的40.8%～63.0%),而Farina等[4]研究表明,芳樟醇(可达90%以上)和异硫氰酸苄酯为挥发性气味的关键。由表6可知,丁酸和芳樟醇是木瓜原汁的主要成分,分别约占总成分的89%和7%。经乳杆菌发酵后的挥发性成分发生了显著性变化,各组丁酸含量显著降低,芳樟醇则略微增加。一般认为,丁酸会产生干酪般甜腻的不愉快气味,引起部分消费者的不适感。芳樟醇及芳樟醇氧化衍生物是木瓜特有香气的主要贡献者之一,是一种带有浓青木青气息,似玫瑰木,属花香型的香气成分[34]。

表6 发酵72 h后木瓜汁中主要挥发性成分

原木瓜汁中主要有6种挥发性成分,包括酸类、醇类、酚类和烷烃类化合物。Lp、Lr、La、Lp+Lr,Lp+La、Lr+La发酵共产生了25种挥发性化合物,生成了许多新的化合物,包括酮类、酯类、芳香类和烷烃类化合物。所有发酵组中,Lp产生的挥发性化合物最多为18种,其次为La(14种)及Lp+La(14种)。Lr产生的主要成分最少,仅4种。Lp+Lr产生的成分也较少(5种)。一般认为,挥发性成分的差异与菌种种类以及菌种的胞内酶有关。在单菌种发酵中,Lp产生的香气成分最多,La产生的香气成分大部分与其类似,与Chen等[18]的结果类似。这可能是因为在乳杆菌属的所有物种中,Lp具有合成部分酶的特有基因,比如酚脱羧酶、单宁酶等[26]。在混合菌发酵中,Lp+Lr产生的香气成分最少,可能是Lp+Lr共同发酵时互相产生拮抗[13],而Lr在所有发酵中菌种存活率最高,因此其在与Lp混合发酵时可能占据优势地位,而Lr单菌发酵时产生的挥发性成分最少,所以混合发酵产生的芳香成分比其他两种混合菌的少。

6个发酵组中,仅Lp产生几种特有的香气成分,包括苯甲醇、丙酸甲酯、甲苯和苯甲醛。据报道[18,35],苯甲醇具有杏仁香气,苯甲醛具有杏仁、樱桃甜味,能给木瓜汁提供更丰富的香气成分。此外,大部分发酵组(Lp、La、Lp+La、Lr+La)中的木瓜汁新增了很多烷烃类物质,其主要来源于脂肪酸烷氧自由基的断裂及对氨基酸的降解代谢过程,由于香味阀值较高,其对木瓜汁的风味贡献较小[25]。发酵后的果汁中均不同程度地增加了令人愉快的水果香气的苯甲醇。

总体来看,乳酸菌发酵可以增加水果汁中挥发性风味物质种类。接种乳酸菌后,木瓜汁中令人不愉快气味的丁酸含量显著降低,香气成分种类显著增加,赋予了木瓜发酵汁独特复杂的香气。使用单一菌种发酵剂Lp比混合发酵剂产生了更多的香气成分,说明Lp在木瓜汁中的适应性较广,单一发酵风味成分更佳。

3 结论

以番木瓜汁作为3种乳酸菌发酵底物,通过对不同发酵物化性质的比较,筛选出了一株更适合发酵的菌株。结果表明,发酵提高了番木瓜汁的总酚、总黄酮含量,对α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶的抑制作用增强。3种乳酸菌均能在番木瓜汁中存活,活菌数>7.00 lg(CFU/mL)。虽然植物乳杆菌和鼠李糖杆菌混菌发酵的活菌数在所有发酵组中最高,但在其他方面尤其是在产香气成分上最差。总的看来,植物乳杆菌在产乳酸,促进总酚、总黄酮含量,抑制葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性以及增加番木瓜风味物质上更具优势。因此,使用植物乳杆菌单一菌株发酵番木瓜汁是首选。后续可深入探究木瓜优势发酵剂发酵的功能机制,如减肥、降血糖等机制,有利于木瓜功能性饮料的实际应用。