脂肪间质干细胞修复犬关节软骨损伤的研究

滕 鑫,艾力·艾尔肯,吕长荣,张欣珂,赵献军,华进联*

(1.西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心,陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学动物医学院西安动物医院,陕西杨凌 712100;3.天津百欧派生物技术有限公司,天津 300000)

软骨组织发育的过程是软骨细胞的增殖、分化以及细胞外基质(ECM)的合成[1]。关节软骨受损,自身很难修复,甚至发生严重功能障碍,甚至导致骨关节炎的发生。犬骨关节炎实际上不是一种简单的炎症,而是一种以各种因素引起的关节软骨变性、破坏与骨质增生为特征的慢性关节病。该病通常由遗传、外伤和年龄等多种因素导致,其影响关节周围的各种组织,如关节软骨、软骨下骨、滑膜和韧带等,在放射学上表现为关节间隙狭窄、软骨下硬化、软骨下囊肿和骨赘形成并包括韧带及其他结构改变的慢性炎症[2]。软骨是受骨关节炎影响的主要组织。随着伴侣动物犬类逐年增多,犬的骨关节炎也日益被人类重视。在1岁以上的犬中,每5只中几乎就有1只具有不同程度的骨关节炎,并且发生率随着年龄的增加而升高,约有95%的病例发生在5岁以上的犬,50%发生在10岁以上的老龄犬。原发的退行性骨关节病一般是随着年龄的增长而导致正常关节的过度磨损形成的。相关研究表明,大量骨关节炎患者存在滑膜炎,且患者关节的炎症和骨关节炎的进展有直接关系,促炎细胞因子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(NO)、基质降解酶和生物力学应激是导致犬骨关节炎形成的主要因素。大量炎症细胞因子参与了软骨新陈代谢活动,可在相互作用下,对软骨细胞造成破坏,如白细胞介素(interleukin,IL)、α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。骨关节炎使犬关节肿胀疼痛、变形、积液,从而引发一系列影响运动功能的障碍,对宠物犬的健康与福利造成了严重损害[3]。

目前,移植 “支架-种子细胞”复合体的进入软骨损伤部位的组织工程学[4]研究很广泛,但该方法需要手术完成,成本高昂的同时也避免不了痛苦。而干细胞无创疗法体现出更多的优势,值得探索研究。间充质干细胞来源广泛、取材简单,而且不涉及各种伦理问题,使得MSCs在软骨组织损伤修复的试验研究中成为热点[5]。

脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)具有免疫细胞趋化作用的相似特性,并在组织病变位置或者缺血位置产生自然代偿性的修复[6]。目前已知有两种解释机制:其一是干细胞在病灶部位各种因素的诱导下发生转分化,从而完成结构与功能的再生;另外一种是干细胞通过旁分泌的形式分泌各种能够促进组织再生的细胞因子[7],这些因子促进原位细胞以更高的效率的进行增殖与分化,最终达到修复损伤的目的[8]。脂肪组织来源间充质干细胞来源于中胚层,具有分化成为多种类型子代细胞的潜力,同时具有很强的增殖能力,在适宜的条件下,不仅可以诱导分化为具有同源性的中胚层的间质细胞,还可以诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、上皮样细胞、心肌细胞、肝细胞等[9]。吕晶等[10]的研究证实,将间充质干细胞与软骨细胞共培养可以获得由间充质干细胞转分化而来的软骨样细胞。间充质干细胞经体外诱导培养所产生的软骨组织在形态和组分上接近于透明软骨[11-14]。犬ADMSCs已被证明具有强大的自我更新和分化潜能,能用于治疗糖尿病、肝损伤及皮肤损伤等多种临床重大疾病。

本研究旨在为干细胞治疗软骨组织损伤性疾病的研究提供可靠的试验证据,为将干细胞推向软骨组织损伤临床治疗提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 本试验使用3只试验用犬:1只1岁雌性田园犬用于分离ADMSCs,2只2岁雌性田园犬用于建立软骨组织损伤的病理模型。所用犬只都已免疫完全,生理指标正常,由西北农林科技大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Ⅰ型胶原酶(collagenase)、α-MEM培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胎牛血清,Gibco公司产品;碳酸氢钠,Sigma公司产品;反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、(SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ),TaKaRa公司产品;Trizol,Invitrigen公司产品;Hoechst 33342,索莱宝公司产品;无水乙醇,成都科隆化学品有限公司产品;氯化钠,上海拓旸生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱,Thermo公司产品;超净工作台,北京亚太克隆公司产品;生物安全柜,美国BAKER公司产品;超纯水净化仪,Millopore公司产品;移液器、离心机,德国Eppendorf公司产品;微量离心机,Sigma公司产品;PCR仪,Bio-Rad公司产品;实时荧光定量PCR仪,Bio-Rad公司产品;荧光倒置显微镜,Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离及标记 在严格无菌条件下,通过外科手术的方式从1岁雌性试验犬的腹膜下脂肪组织和肠系膜脂肪组织处采集脂肪样本,并将脂肪样本置于无菌PBS(pH 7.4)中封口待用。试验用犬术后由专人护理直至康复。

使用培养液对脂肪样本重复清洗3次,然后用剪刀剪碎至1 mm3的碎末状。配置1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液,过滤后在37 ℃条件下预热。使用该溶液对脂肪样本反复吹吸,然后将混悬液体收集到50 mL离心管中封口备用。将离心管置于37 ℃恒温水浴振荡器中消化1 h,期间每隔5 min上下颠倒混匀。消化完毕后,使用等量培养液终止消化,在1 000 r/min条件下先后离心2次,分离出成熟的脂肪组织。将1 mL含有10%FBS的α-MEM培养液加入离心管中混匀,随后移入6孔板,在体积分数为5%的CO2条件下、37 ℃的恒温培养箱中孵育。当细胞密度达到80%后,用0.25%的胰酶溶液消化细胞,并1∶3传代培养。将分离培养的第3代犬ADMSCs悬液接种于24孔板中,在37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养至细胞密度扩增到60%时,使用MOI=200的慢病毒载体进行转染标记。孵育至8 h时进行换液培养,孵育至48 h时,在荧光倒置显微镜下检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。

1.2.2 病理模型的建立 以每只试验用犬的左右两后肢互为对照,左侧作为对照组,右侧作为试验组。术前对试验用犬采血化验,血常规、血液生化指标均正常。术式:在试验用犬膝关节前外侧近端位置开始切口,并向下沿伸至胫骨粗隆下方2～3 cm处。依次切开皮肤、关节副韧带、关节囊,暴露关节腔,可见髌骨及滑车沟。使用骨锉侧面(宽2 mm)在滑车沟软骨正中线上进行打磨,造出长度15 mm、宽度2 mm、深度3 mm的沟槽。使用冲洗液对打磨位置进行清洗。最后依次缝合关节囊、肌肉、皮肤,整合皮肤伤口后并做常规处理。两侧膝关节按照相同术式与要求进行手术处理。术后护理主要以防止伤口感染为主,辅以止痛和能量补充。

1.2.3 细胞准备与移植 取纯化培养的第3代犬ADMSCs,胰酶消化、离心,PBS缓冲液清洗2次,将细胞用无血清添加的α-MEM培养液稀释成5×107个/mL的细胞悬液备用。术后2周,手术部位皮肤伤口愈合后进行拆线,并进行第1次细胞移植,术后3周进行第2次细胞移植。在严格无菌条件下,使用注射器吸取2 mL上述细胞悬液,以右侧膝关节缝为注射点,将细胞悬液注射进入关节腔。左侧膝关节缝按同样方法注射等体积无血清添加的培养液。

1.2.4 取样 第2次移植细胞11周后对病理模型进行取样。采取1.2.2所述方法打开膝关节腔,在关节滑车沟内使用手术刀对新生软骨组织进行切削取样,每侧滑车沟取2份样品,分别置于盛有1 mL PFA和200 μL Trizol试剂的离心管中。

1.2.5 组织学检测 将经4%多聚甲醛固定的软骨组织样品送至杨凌示范区医院病理科进行石蜡包埋并进行连续切片。将切片分为两组,分别用于HE染色和免疫组化染色,并观察拍照。

1.2.6 实时荧光定量PCR 用Trizol法提取软骨组织细胞总RNA。RNA的纯度和浓度用核酸蛋白分析仪测定,保存于-80 ℃备用。在NCBI网站查得透明软骨的标志性基因COL2a1的mRNA序列,并以此设计引物序列(表1)。cDNA合成及real-time PCR严格参照试验所用试剂盒操作说明书进行。

2 结果

2.1 转染EGFP基因的ADMSCs

分离培养后的第3代犬ADMSCs经转染标记48 h后,在荧光倒置显微镜下观察细胞形态与GFP的表达情况。细胞贴壁生长,状态良好,细胞形态呈短梭形、三角形或多角形,EGFP阳性率为60%(图1)。

图1 EGFP转染犬ADMSC的荧光照片(200 μm)Fig.1 Expression of EGPF in ADMSCs cells(200 μm)

2.2 犬膝关节软骨组织损伤的病理模型与新生组织的大体观察

通过外科手术的方式在关节内造出长度15 mm、宽度2 mm、深度3 mm的缺损沟槽(图2D),作为软骨组织损伤的病理模型。

A.确定打开关节腔的手术位置;B.打开关节腔;C.手术建立软骨组织缺损;D.软骨组织损伤病理模型A.Determine the surgical location for opening the jointcavity; B.Open the joint cavity; C.Surgical establishment of cartilage tissue defects; D.Pathological model of cartilage tissue injury图2 手术建立软骨组织缺损模型Fig.2 Procedures involved in the establishment of the surgical cartilage defect

细胞移植11周后,按照前述建立膝关节软骨组织缺损病理模型的方法对试验样本进行取样。首先对新生组织的表观特征进行观察(图3)。模型1对照组软骨缺损处覆盖了新生组织薄层(图3A);模型1试验组的新生组织较厚(图3B)。模型2对照组的新生组织覆盖了中心区域,而纵向两侧覆盖较薄(图3C);模型2试验组的新生组织对于缺损位置的填充相对完整(图3D)。

A.模型1对照组;B.模型1试验组;C.模型2对照组;D.模型2试验组A.Model 1 control group; B.Model 1 test group;C.Model 2 control group; D.Model 2 test group图3 新生组织的大体观察Fig.3 General observation of the newly formed tissue after cAMSCs transplantation

2.3 新生组织石蜡切片的HE染色结果

将新生组织制作成石蜡切片并进行HE染色。由图4可见,两组试验模型中,对照组的新生组织中细胞外基质(ECM)成分不一、密度不均(图4A、C),而犬AD-MSCs移植组具有相对均一的ECM(图4B和图4D)。

A.模型1对照组;B.模型1试验组;C.模型2对照组;D.模型2试验组A.Model 1 control group; B.Model 1 test group; C.Model 2 control group; D.Model 2 test group图4 石蜡切片HE染色(标尺=50 μm)Fig.4 HE staining of the newly formed tissue from the injured site (Bar=50 μm)

2.4 新生组织Ⅱ型胶原蛋白的免疫荧光检测

将新生组织制作石蜡切片并进行Ⅱ型胶原蛋白的免疫荧光染色。在两组病理模型的样本中,使用犬AD-MSCs移植治疗的试验组表现出明显的Ⅱ型胶原蛋白阳性(图5B和图5D),而在对照组中仅可见少量细胞周围较弱的阳性(图5A和图5C)。

A.模型1对照组;B.模型1试验组;C.模型2对照组;D.模型2试验组A.Model 1 control group; B.Model 1 test group;C.Model 2 control group; D.Model 2 test group图5 Ⅱ型胶原蛋白的免疫荧光染色(标尺=50 μm)Fig.5 Immunofluorescence staining of type Ⅱ collagen (Bar=50 μm)

2.5 新生组织COL 2a1的mRNA水平检测

使用实时荧光定量PCR对两组模型样本进行COL 2a1 mRNA相对水平的检测。由图6可见,试验组,即犬AD-MSCs移植治疗组,比对照组具有更高水平的COL 2a1 mRNA含量,证明试验组中Ⅱ型胶原蛋白的基因具有明显较高的表达水平,即新生组织成分更接近于透明软骨。

3 讨论

本试验在我们已有的犬脂肪间质干细胞培养克隆体系基础上,建立了GFP标记的犬脂肪间质干细胞细胞株,利用人工精准造成犬关节软骨损伤,将GFP标记的ADMSCs移植入受损的犬关节腔,并进行了系统的检测和评价,证实移植ADMSCs能有效缓解犬关节软骨损伤。

本试验采用注射的方法将犬ADMSCs移植进入关节腔,其内的关节滑液为试验细胞提供了直接的细胞外环境,其中可能就包含了可以诱导ADMSCs向软骨细胞分化的细胞因子和相关的小分子物质及微环境[7-8,11]。另外,软骨组织损伤部位的切面也暴露了软骨基质内的原位软骨细胞,提供了其与移植进入的间充质干细胞直接接触的机会。

综上所述,关节腔内的环境,提供了软骨细胞与试验细胞天然的共培养环境,为ADMSC向软骨细胞的分化以及修复受损的关节软骨创造了可能。

另外,本试验中试验组的软骨组织缺损修复效果明显优于对照组,结合GFP阳性率和Ⅱ型胶原蛋白的表达水平两方面试验数据推测,干细胞在关节腔内以共培养的形式向软骨细胞方向发生了分化,并形成了以Ⅱ型胶原蛋白为主的ECM。本研究建立了移植原代及GFP标记犬脂肪间充质干细胞修复犬软骨组织缺损关节模型,为干细胞治疗临床软骨组织损伤提供了重要的科学依据。