急性脑梗死患者血清miR-22-3p、NLRP3水平与炎性因子及预后不良的关系

凌雪辉,许文杰,秦勇,王枫

脑卒中因其高发病率、高残疾/病死率、高复发率等特点成为严重危害我国居民生命健康的慢性非传染性疾病[1]。急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)占脑卒中的69.6%～70.8%,主要因脑血管闭塞导致局部脑血液灌注中断引起[2],目前患者预后仍然较差[3-4]。准确评估ACI患者预后对促进其预后改善非常重要。炎性反应在ACI发生发展中扮演重要角色[5]。研究表明,微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)能通过调控炎性反应参与ACI发生发展[6]。miR-22-3p是一个炎性相关miRNA,能通过调控多种靶基因抑制炎性反应[7]。有学者发现miR-22-3p与ACI患者免疫浸润相关[8]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是一种炎性小体,能通过促进促炎细胞因子释放参与炎性反应过程[9]。实验发现NLRP3在ACI小鼠脑组织中高表达[10]。本研究拟探讨ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3水平与炎性因子及预后不良的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年1月—2022年12月上海中医药大学附属第七人民医院神经内科收治ACI患者106例为ACI组,女46例,男60例,年龄33～81(59.61±8.85)岁;另选取同期体检健康者60例为健康对照组,女26例,男34例,年龄18～73(57.13±12.67)岁;2组人员性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(2021-02-034),全部受试者或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①有完整的临床和随访资料;②符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》ACI诊断标准[11];③接受静脉溶栓或血管内治疗或联合静脉溶栓。(2)排除标准:①已知明显出血倾向、严重活动性出血、既往颅内出血病史;②既往脑部手术史或近3个月内脑外伤史;③恶性肿瘤;④院内死亡;⑤有严重的心、肝、肾功能不全;⑥合并自身免疫性疾病;⑦年龄<18岁;⑧妊娠及哺乳期妇女;⑨合并血液系统疾病。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-22-3p水平检测:收集ACI患者治疗前和健康对照组体检时空腹肘静脉血3 ml,离心留存血清。部分血清使用TRIzol试剂盒(购自北京简石生物技术有限公司,货号TR205)提取总RNA,取部分样本使用紫外分光光度仪器(购自日本日立公司,型号 3900H)鉴定纯度和完整性合格后。剩余RNA使用TaKaRa逆转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司,货号 4366597)逆转录为cRNA,再使用实时荧光定量聚合酶链式反应仪(购自上海伯乐生命医学产品有限公司,型号 CFX96 Touch)按照聚合酶链式反应试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司,货号 GK0221)说明书进行检测。miR-22-3p上游引物5’-ATGGCATAATCCGGGTGCAA-3＇、下游引物5’-TGTCGCAGATCCAGTCTGATG-3＇;内参U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3＇、下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇;反应总体积共25 μl,cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、2×Hieff®PCR Master Mix 10 μl、去离子水7 μl;循环参数:95℃ 5min 1次,94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s,共计40次。以2-ΔΔCT法计算血清miR-22-3p相对表达量。

1.3.2 血清NLRP3、炎性因子水平检测:剩余血清采用酶联免疫吸附试剂盒(购自北京伊塔生物科技有限公司,货号 YK-06198、YK-00656、YK-00504、YK-00440)检测NLRP3和炎性因子[白介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]水平。

1.3.3 资料收集:收集ACI患者性别、年龄、吸烟、饮酒、合并症、梗死部位、Org 10172在急性脑卒中治疗中的试验(TOAST)分型[12]、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)[13]、收缩压、舒张压、血糖、血脂四项、血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数等资料。

1.3.4 随访和分组:通过门诊或电话对患者出院后随访3个月,使用改良Rankin量表评估预后,总分值0～6分,≥3分表示预后不良[14]。根据改良Rankin量表评分将ACI患者分为预后不良亚组和预后良好亚组。

2 结 果

2.1 2组血清miR-22-3p、NLRP3和炎性因子水平比较 ACI组血清miR-22-3p水平低于健康对照组,血清NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平高于健康对照组(P<0.01),见表1。

表1 ACI组与健康对照组血清miR-22-3p、NLRP3和炎性因子水平比较Tab.1 Comparison of serum levels of miR-22-3p, NLRP3 and inflammatory factors between the ACI group and the healthy control group

2.2 ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3与炎性因子水平的相关性 Pearson相关性分析显示,血清miR-22-3p与NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平均呈负相关(r=-0.733、-0.719、-0.683、-0.680,P均<0.001),血清NLRP3与IL-1β、IL-18、TNF-α水平均呈正相关(r=0.716、0.715、0.707,P均<0.001)。

2.3 2亚组ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3及临床资料比较 随访3个月,106例ACI患者预后不良37例(34.91%)。 预后不良亚组患者年龄大于预后良好亚组,血管内治疗或联合静脉溶栓比例、NIHSS评分、IL-1β、IL-18、TNF-α、NLRP3水平高于预后良好亚组,miR-22-3p水平低于预后良好亚组(P<0.01),2亚组患者性别、吸烟、饮酒、合并症、梗死部位、TOAST分型、血脂、血压、血糖、白细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞计数等资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 预后不良亚组和预后良好亚组ACI患者临床资料比较Tab.2 Comparison of clinical data of ACI patients with poor prognosis and good prognosis

2.4 ACI患者预后不良的多因素Logistic回归分析 以ACI患者预后情况(赋值:不良=1,良好=0)为因变量,以上述结果中P<0.05项目为自变量,建立多因素Logistic回归模型。结果显示:NIHSS评分高、IL-1β高、IL-18高、TNF-α高、NLRP3升高为ACI患者预后不良的独立危险因素(P<0.05),miR-22-3p升高为保护因素(P<0.05),见表3。

表3 ACI患者预后不良的多因素Logistic回归分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of poor prognosis of ACI patients

2.5 血清miR-22-3p、NLRP3水平预测ACI患者预后不良的价值 绘制血清miR-22-3p、NLRP3水平预测ACI患者预后不良价值的ROC曲线,并计算AUC,结果显示:血清miR-22-3p、NLRP3水平联合预测ACI患者预后不良的AUC为0.875,大于血清miR-22-3p、NLRP3水平单独预测的0.786、0.759(Z=2.405、2.517,P=0.016、0.012),见表4和图1。

图1 血清miR-22-3p、NLRP3水平预测ACI患者预后不良的ROC曲线Fig.1 ROC curves of serum miR-22-3p and NLRP3 levels predicting poor prognosis in ACI patients

表4 血清miR-22-3p、NLRP3水平对ACI患者预后不良的预测价值Tab.4 Predictive value of serum miR-22-3p and NLRP3 levels in poor prognosis of ACI patients

3 讨 论

ACI是颅内供血动脉血栓闭塞导致的局限性脑组织缺血、缺氧或坏死并引起相应神经症状的急性脑血管疾病,及时恢复受损脑组织供血和挽救尚未死亡的神经组织是改善ACI患者神经功能的重要治疗目的[11]。近年来随着药物、技术和材料的改进,ACI患者静脉溶栓或血管内治疗后预后得以显著改善,但仍有部分患者因ACI后缺血再灌注损伤、血脑屏障破坏、凝血功能紊乱等原因导致神经损伤加重,进而降低预后[4,15]。本组ACI患者预后不良发生率为34.91%,与王丽香等[16]报道的36.74%接近,说明ACI患者预后不良发生率较高。

炎性反应贯穿ACI发生发展全过程,在ACI发病初期炎性反应能损伤血管内皮促进动脉粥样硬化和血栓形成,导致ACI发生;ACI发病后炎性反应又能加剧神经损伤、缺血再灌注损伤、血脑屏障破坏等导致患者预后降低[5]。IL-1β、IL-18、TNF-α是ACI病理过程中常见的促炎细胞因子,本研究结果显示,IL-1β、IL-18、TNF-α升高为ACI患者预后不良的独立危险因素,说明炎性反应增强会降低ACI患者预后,符合上述研究报道。miRNA是一种非编码小RNA,能通过结合靶基因3'-非翻译端抑制蛋白质翻译,负向调控靶基因表达进而参与ACI炎性反应过程[17]。miR-22-3p定位于人染色体9q34.3,最初研究发现miR-22-3p能特异性抑制内皮细胞炎性反应,因而近年来多项研究报道了miR-22-3p的抗炎作用,如miR-22-3p能靶向高迁移率族蛋白B1/ Toll样受体4/核因子-κB信号通路,进而缓解脓毒症诱导的肾细胞炎性反应[18];miR-22-3p还能靶向上调沉默信息调节因子2相关酶1减轻铅诱导的神经细胞炎性反应[19]。同时Zhang等[20]实验指出,上调miR-22-3p能抑制ACI大鼠神经细胞IL-1β、IL-18表达,进而改善脑缺血/再灌注损伤。本研究结果也显示,ACI患者血清miR-22-3p与IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈负相关。基于此推测miR-22-3p可能通过炎性反应影响ACI患者预后。本研究结果显示,ACI患者血清miR-22-3p水平降低,miR-22-3p水平升高是ACI患者预后不良的独立保护因素,说明血清miR-22-3p水平升高能降低ACI患者预后不良风险。其原因可能是miR-22-3p水平升高能通过靶向多种基因抑制神经炎性反应和血脑屏障破坏,缩小梗死面积并增强神经细胞活性,进而改善ACI患者预后[21]。

NOD样受体是真核生物免疫细胞感知危险的主要途径,机体在免疫反应起始阶段能通过NOD样受体等损伤相关模式分子介导免疫炎性反应过程[22]。NLRP3是NOD样受体家族研究最多的成员,主要表达于皮肤、眼睛、肝、肾、肺、结肠等,在被炎性反应等危险信号分子或病原体激活后能募集前体半胱氨酸蛋白酶-1聚集形成NLRP3炎性小体,促进IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子成熟和分泌,促进炎性反应发展和细胞炎性坏死(细胞焦亡)[23-25]。蒋洁等[26]实验报道,抑制NLRP3表达能抑制炎性反应,进而改善脑缺血再灌注大鼠神经功能。王丽轩等[27]研究指出,血清NLRP3水平与ACI患者恶性脑水肿发生独立相关。同时本研究结果显示,ACI患者血清NLRP3与IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈正相关。因此推测NLRP3可能通过炎性反应影响ACI患者预后。本研究结果显示,血清NLRP3水平升高是ACI患者预后不良的独立危险因素,说明血清NLRP3水平升高会增加ACI患者预后不良风险。其原因可能是NLRP3水平升高能通过内外源性损伤相关分子模式完成自身组装活化,促进IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子分泌,加剧神经炎性反应和血脑屏障破坏,导致预后不良风险增加[28-29]。

本研究相关性分析发现,ACI患者血清miR-22-3p与NLRP3水平呈负相关,提示miR-22-3p和NLRP3可能共同影响ACI患者预后。最近李利超等[30]实验也报道,上调miR-22-3p能靶向下调NLRP3抑制脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞炎性坏死,进一步佐证了本研究结果。此外本研究结果还显示,NIHSS评分升高反映神经缺损更严重,故预后更差。通过绘制ROC曲线发现,血清miR-22-3p、NLRP3水平为0.89、152.84 ng/L时,预测ACI患者预后不良的AUC分别为0.786、0.759;血清miR-22-3p、NLRP3水平联合预测的AUC为0.875,大于miR-22-3p、NLRP3单独预测。说明检测血清miR-22-3p、NLRP3水平有助于ACI患者预后预测,且联合检测血清miR-22-3p、NLRP3水平能提升预测价值。但本研究结果还需多中心研究进一步验证。

综上所述,血清miR-22-3p水平降低和NLRP3水平升高与ACI患者炎性因子水平升高有关,是预后不良的独立危险因素。血清miR-22-3p、NLRP3水平预测ACI患者预后不良的价值较高,可能成为ACI患者预后不良的辅助预测指标。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

凌雪辉:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;许文杰:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;秦勇:资料搜集整理,进行统计学分析;王枫:提出研究思路,分析试验数据,论文审核