结直肠癌组织miR-330-5p、PTBP1的表达与病理参数和预后的关系

周钰杰,杨芳,严晶,钱政,马鸿旭

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,2020年全球结直肠癌新发病例数1 931 590例、死亡935 173例,中国新发病例数555 477例、死亡286 162例,已成为严重危害我国及全球人民生命健康的公共卫生问题[1]。尽管近年来结直肠癌的诊治取得一定进展,但患者预后仍然较差,早期结直肠癌5年生存率可达90%,晚期5年生存率仅15%[2]。因此研究结直肠癌患者预后影响相关因素非常重要。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在结直肠癌进程中扮演重要角色[3]。研究报道[4],miR-330-5p在结直肠癌组织和细胞中低表达;同时有学者指出[5],miR-330-5p与胃癌患者预后有关。多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract binding protein 1,PTBP1)是一种RNA结合蛋白,能通过调节肿瘤细胞上皮间质转化、能量代谢、免疫等影响肿瘤进展[6]。研究报道[7],PTBP1在结直肠癌细胞中高表达;同时PTBP1表达与非小细胞肺癌患者预后有关[8]。但关于miR-330-5p、PTBP1对结直肠癌的临床意义尚缺乏研究报道,基于此本研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2020年5月南通市中医院肛肠科收治结直肠癌患者101例,男59例、女42例;年龄22～75岁,≥60岁49例、<60岁52例。根据miR-330-5p、PTBP1 mRNA在结直肠癌组织表达均值分为高/低表达组。术中收集部分癌组织及其癌旁组织,存于液氮中。本研究经医院伦理委员会批准,患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①年龄≥18岁;②经病理检查确诊为结直肠癌[9];③TNM分期Ⅰ～Ⅲ期[10]。(2)排除标准:①不具备手术指征;②合并其他恶性肿瘤或入院前已接受任何抗肿瘤治疗;③合并急慢性感染;④临床资料不完整或不能接受随访;⑤合并克罗恩病、溃疡性结肠炎等其他肠道疾病。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 miR-330-5p、PTBP1 mRNA水平检测:液氮下碾磨组织标本,使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的TRIzol试剂盒(编号 R401-01)提取总RNA,分光度计测定纯度合格后(吸光度260/280比值1.8～2.0),宝日医生物技术(北京)有限公司提供的Takara试剂盒(编号 RR037B)逆转录为互补DNA(条件:42℃ 30 min,85℃ 5 min)。以互补DNA为模板,按照实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,编号 11202ES08]说明书进行扩增,反应体系:Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 10 μl、上下游引物各0.4 μl、模板DNA 5 μl、无菌超纯水加至总体积25 μl;扩增程序:95℃ 5 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s,共计40次。获取循环阈值(cycle threshold,CT),2-ΔΔCT法计算组织miR-330-5p、PTBP1 mRNA相对表达量。miR-330-5p上游引物5′-TCTCTGGGCCTGTGTCTTAGGC-3′、下游引物5′-CTAAGACACAGCCCAGAGATT-3′;U6上游引物5′-GAGCAGAAACATAAGCTGT-3′、下游引物5′-GCAGAAACATAAGCTGTGG-3′;PTBP1上游引物5′-CTCAACCTCTACATTATACCTAA-3′、下游引物5′-CCTAGGGACCCTGGTATGGATC-3′;GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.3.2 随访情况:结直肠癌患者出院后随访3年(电话或门诊6个月1次),随访至患者死亡或2023年5月,统计总生存率。

2 结 果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织miR-330-5p、PTBP1 mRNA表达比较 结直肠癌组织miR-330-5p表达为(0.57±0.11),低于癌旁组织(1.00±0.15);PTBP1 mRNA表达为(1.50±0.20),高于癌旁组织(0.95±0.18)(t=24.000、19.233,P均<0.001)。

2.2 结直肠癌组织miR-330-5p与PTBP1 mRNA表达的相关性 经Targetscan数据库预测显示,miR-330-5p与PTBP1存在结合位点,见图1;Pearson相关性分析显示,结直肠癌组织miR-330-5p与PTBP1 mRNA表达呈负相关(r=-0.679,P<0.001)。

图1 miR-330-5p与PTBP1结合位点Fig.1 Binding sites of miR-330-5p to PTBP1

2.3 结直肠癌组织miR-330-5p与PTBP1 mRNA表达在不同临床病理参数中比较 不同性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小中结直肠癌组织miR-330-5p、PTBP1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与低分化程度、TNM Ⅲ期 、有淋巴结转移、中高分化程度、TNMⅠ～Ⅱ期、无淋巴结转移结直肠癌组织miR-330-5p升高、PTBP1 mRNA表达降低比较(P<0.05或P<0.01),见表1。

表1 结直肠癌组织miR-330-5p与PTBP1 mRNA表达在不同临床病理参数中差异比较Tab.1 Comparison of differences in miR-330-5p and PTBP1 mRNA expression in colorectal cancer tissues under different clinical and pathological parameters

2.4 结直肠癌组织miR-330-5p、PTBP1 mRNA表达与总生存率的关系 101例结直肠癌患者高/低miR-330-5p表达分别57例、44例,高/低PTBP1 mRNA表达分别45例、56例。随访结束,有4例失访,17例死亡,3年总生存率为82.47%(80/97) 。K-M生存曲线分析显示,miR-330-5p高表达组(≥0.57)3年总生存率91.23%(52/57)高于低表达组(<0.57)的72.73%(32/44)(Log-rankχ2=6.466,P=0.011);PTBP1 mRNA高表达组(≥1.50)3年总生存率68.89%(31/45)低于低表达组(<1.50)的94.64%(53/56)(Log-rankχ2=11.697,P=0.001),见图2。

图2 高/低miR-330-5p、PTBP1 mRNA表达结直肠癌患者K-M生存曲线Fig.2 K-M survival curve of colorectal cancer patients with high/low miR-330-5p and PTBP1 mRNA expression

2.5 影响结直肠癌患者预后的多因素Cox回归分析 以随访时间为时间变量,影响结直肠癌患者预后为因变量(赋值:死亡/存活=1/0),性别(赋值:男/女=1/0)、年龄(赋值:≥60岁/<60岁=1/0)、肿瘤位置(赋值:结肠/直肠=1/0)、肿瘤直径(赋值:≥5 cm/<5 cm=1/0)、分化程度(赋值:低分化/中高分化=1/0)、TNM分期(赋值:Ⅲ期/Ⅰ～Ⅱ期=1/0)、miR-330-5p(赋值:≥0.57/<0.57=1/0)、PTBP1 mRNA(赋值:≥1.50/<1.50=1/0)为自变量,进行多因素Cox回归模型分析。结果显示:结直肠癌患者死亡的独立危险因素为低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移和PTBP1 mRNA≥1.50,独立保护因素为miR-330-5p≥0.57(P<0.05),见表2。

表2 影响结直肠癌患者预后的多因素Cox回归分析Tab.2 Cox regression analysis of multiple factors affecting the prognosis of colorectal cancer patients

3 讨 论

结直肠癌发病可能与环境、遗传、生活饮食习惯、药物使用等有关,83%的结直肠癌患者在初诊时处于中晚期,失去最佳治疗时机[11-12]。尽管近年来免疫、靶向药物有助于改善晚期结直肠癌预后,但由于晚期结直肠癌极易发生多部位转移,其临床获益有限,且随着治疗时间延长获得性耐药愈发严重,导致患者总体预后仍然较差[13-14]。研究结直肠癌患者预后影响机制,对指导治疗措施制定和促进预后改善意义重大。

非编码RNA能通过调控表观遗传机制改变参与恶性肿瘤过程,miRNA作为一种单链非编码RNA,能通过靶基因互补配对降解或抑制mRNA翻译,进而调控结直肠癌进程[3]。miR-330-5p定位于人染色体19q13.32,是一个与肿瘤密切相关的miRNA,如miR-330-5p能靶向CCHC型锌指核酸结合蛋白抑制黑色素瘤细胞生长和侵袭[15];miR-330-5p能靶向单羧酸转运蛋白4促进膀胱癌糖酵解和细胞生长[16]。实验报道,上调miR-330-5p能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡[4]。另有研究指出,miR-330-5p与宫颈癌、三阴性乳腺癌患者预后有关[17-18]。因此笔者推测miR-330-5p可能影响结直肠癌患者预后。本结果显示,结直肠癌组织miR-330-5p表达下调,与不良病理特征有关,符合上述研究结果,说明miR-330-5p低表达参与结直肠癌发生发展。分析其机制可能是miR-330-5p表达降低会导致Wnt/β-连环蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1信号通路激活,上调多种原癌基因,从而促进结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭[19-20]。

RNA结合蛋白PTBP1定位于人染色体19q13.3,不仅能调控mRNA翻译、稳定性等加工过程影响肿瘤进程,还能作为剪接因子结合靶基因前体mRNA的特定序列产生不同mRNA亚型,进而通过Warburg效应、细胞周期、运动、分化、凋亡和免疫等促进恶性肿瘤进展[21]。如PTBP1能正向调控葡萄糖转运蛋白1、己糖激酶2和乳酸脱氢酶A等糖酵解酶表达,促进胃癌细胞生长和耐药[22];抑制PTBP1能抑制上皮间质转化,降低黑色素瘤细胞增殖活性和迁移、侵袭能力[23];抑制PTBP1能促进肺腺癌细胞免疫浸润,进而抑制肺腺癌细胞增殖和迁移[24]。实验报道,下调PTBP1能抑制结直肠癌细胞转移与侵袭[7]。有研究指出,PTBP1与胃癌、骨肉瘤患者预后有关[25]。因此推测PTBP1可能影响结直肠癌患者预后。本结果显示,结直肠癌组织PTBP1 mRNA表达上调,与不良病理特征有关,说明PTBP1 mRNA高表达参与结直肠癌发生发展。分析其机制可能与PTBP1 mRNA高表达能增强结直肠癌细胞能量代谢、细胞周期进展、上皮—间质转化和免疫逃逸,进而促进结直肠癌恶性进展有关[6,21]。

本结果发现miR-330-5p与PTBP1存在结合位点,且二者在结直肠癌组织中表达呈负相关,提示miR-330-5p与PTBP1可能共同参与结直肠癌进展。王磊等[26]报道,上调miR-330-5p能靶向抑制PTBP1促进结肠癌细胞凋亡。本研究发现,miR-330-5p高表达患者3年总生存率升高,可降低结直肠癌患者死亡风险,PTBP1 mRNA高表达患者3年总生存率降低,会增加结直肠癌患者死亡风险。这说明miR-330-5p、PTBP1 mRNA表达与结直肠癌患者预后有关,有望成为患者预后潜在指标。但本研究结果还有待进一步分析。

综上所述,miR-330-5p低表达和PTBP1 mRNA高表达可能共同参与结直肠癌组织进展,与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

周钰杰:提出研究思路,实施研究过程,分析试验数据,统计学分析,论文撰写,论文审核;杨芳:设计研究方案,实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;严晶:提出研究思路,分析试验数据,论文审核,课题设计;钱政:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;马鸿旭:统计学分析