丹蛭降糖胶囊对db/db 小鼠摄食行为及脑摄食中枢α-MSH、AgRP 的调节作用研究

毕 正，鲁云霞，张银玉，李金菊，周 恒，吕溪娟，方朝晖

（1. 安徽中医药大学，合肥 230012；2. 安徽医科大学，合肥 230031；3. 安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031）

糖尿病流行病学调查研究[1]显示，我国糖尿病患者已超过1.5 亿人。糖尿病群体的不断扩大给疾病的防治带来新的挑战与要求。糖尿病患者中90%以上的患者都是2 型糖尿病[2]，而2 型糖尿病的病因极为复杂并且受多种因素的影响，其中长期过量进食引起的肥胖是2 型糖尿病发生发展的重要因素之一[3]。

丹蛭降糖胶囊（Danzhi Jiangtang Capsule，DJC）是安徽中医药大学第一附属医院的一款院内制剂，用于2 型糖尿病患者的治疗已有30 年历史。课题组前期研究发现丹蛭降糖胶囊能够改善糖尿病患者的多食行为，具有降低体质量，调节血脂，降低BMI 指数等功效[4-6]。db/db 小鼠是是瘦素受体基因（Obese Gene Receptor，OB-R）纯合突变小鼠，具有“体质量快速增长，活动量少，高血脂，高血糖，高血压及肥胖等特点”，是模拟肥胖型2 型糖尿病的高保真动物模型[7]。本研究旨在观察丹蛭降糖胶囊对db/db 小鼠体质量及摄食量的干预作用及对下丘脑摄食中枢关键因子的调节作用进行研究。

1 材料

1.1 实验动物

实验动物均购自江苏集萃药康集团，分别购入SPF 级雄性db/db 小鼠18 只及SPF 级雄性db/dm 小鼠9 只，周龄均为5 周，db/db 小鼠体质量在30 ～35 g 之间，db/dm 小鼠体质量在15 ～20 g 之间。动物到达后饲养于安徽医科大学中心动物房SPF 级动物房层流架，饲养环境维持12 h 昼夜交替，温度为（22±2）℃，湿度为50%～55%，动物自由摄食饮水，普通饲料喂养，均使用刨花垫料。本研究已通过安徽医科大学伦理委员会审批（伦理号：LLSC20200932）。

我国是农业大国，对农机设备有很高的要求。随着农机总量的不断扩大，新的农机装备也在不断涌现，导致我国的农业生产方式逐渐由人畜生产力向机械生产力转移，基本上摆脱了几千年的劳动力作业形式，但是，这样势必会给整个农机安全监理带来巨大的压力和挑战。

1.2 试剂与耗材

血糖仪、 血糖试纸（Roche； 国械注进20142404948、国械注进20162402313）； Rabbit-Anti-AgRP Antibody（Abcam；ab254558）、Rabbit-Anti-α-MSH antibody （Bioss；bs-1848R）； 小 鼠α-MSH ELISA 试剂盒、小鼠AgRP ELISA 试剂盒、（晶美生物技术有限公司；96T；JM-12489M1、JM-13042M1）；免疫组化二步法试剂盒（中杉金桥；PV6000）；SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Servicebio；G3337-100）；EZ-10 总RNA 小量提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司；B618583]；2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal；RK21203），qRT-PCR 仪（ABI；StepOne Plus）。

2 实验方法

2.1 入组及饲养

见表5。

见图2、表4。

2.2 检测方案

然而，目前的文献多是纯粹的飞行器或无人潜艇的路径规划问题，缺乏对信息采集结合路径规划的研究。飞行器上搭载信息采集设备不仅需要飞行器在飞行过程中规避障碍物，还需要确保信息采集设备能够采集到相应的数据信息。

2.3 麻醉及采血

饲养结束后在无菌环境下使用0.3%戊巴比妥钠0.1 ～0.2 mL·10 g-1腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰卧位固定小鼠四肢，常规消毒后经腹中线开腹并开胸，使用1 mL 注射器经右心室直刺入3 mm 见针管回血停止进针，缓慢抽取血液，取血完毕经无菌EP 离心管壁缓慢注入并室温静止1 h，后放入离心机经3 500 rpm·5 min-1分离血清，新管-80℃保存备用。

见表6。

2.4 样本采集

小鼠采血完毕，分离头颈，剥离头皮，使用弯头眼科剪插入头骨前囟1 ～2 mm，钝性分离头骨，取出完整脑组织，石蜡包埋样本放入10%甲醛固定液，第2 天换液固定1 周，取出脑组织修块后脱水包埋下丘脑部分；其余小鼠脑组织使用冻存管保存与液氮过夜，第2 天放入-80℃冰箱保存备用。

Xiao课题组设计合成了一种双光子汞离子探针SPF-TSA(见图5)。在加入一定浓度的汞离子后，缩硫醛与汞离子作用转化成醛基，在DMSO∶水=1∶1的溶液中，其检测限为28 nmol/L。在800 nm波长的双光子激发下，探针的双光子截面为248 GM，探针与汞离子反应之后，双光子截面为686 GM，说明探针与汞离子作用后，具有较好的双光子性能，将该探针成功应用于双光子细胞成像。

2.5 观察指标及检测方法

2.5.1 HE 染色 蜡块切片3 μm，常规脱水后入苏木素染30 s，流水冲洗10 min 反蓝，再入伊红10 s后烘干，中性树脂封片烘干后光镜下观察组织病理学改变。

见表2。

2.5.2 免疫组化 蜡块切片3 μm，常规脱水后入柠檬酸盐缓冲液，放入微波炉高火10 min，冷却5 min，再高火3 min 进行抗原修复，根据组化试剂盒说明书进行，一抗（α-MSH 1:250、AgRP 1:100）4℃过夜，最后用DAB 显色10 min，自来水冲洗后烘干，中性树脂封片。选取3 块不同区域，以平均光密度AOD 作比较，AOD = IOD/Area。数据保留小数点后4 位。

2.5.3 qRT-PCR 提取RNA 后使用试剂盒进行逆转录得到样本cDNA，然后使用试剂盒配制反应物，详细操作按照说明书进行。qRT-PRC 反应程序为预变性95 ℃3 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s 循环反应，次数为40 次，熔解曲线由机器自设。以Actin 为内参。2-△△CT为结果。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5.4 ELISA 具体方法按照说明书进行，检测血清α-MSH、AgRP 含量，剥离冻存脑组织下丘脑后使用电子天平称重，称量同质量组织检测下丘脑α-MSH、AgRP蛋白浓度，血清及脑组织样本稀释倍数均为5倍。

2.6 统计学方法

使用SPSS 24.0 进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异使用单因素方差分析进行检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。数据可视化采用GraphPad Prism 8 处理，组化定量使用Imgae J 处理。

每日测量每笼盒所剩饲料，以1 周为记录点进行统计。每周对每只小鼠的体质量测量1 次。

3 结果

3.1 各组体质量周变化情况比较

为了促进喂养工作的科学合理化，在实际执行中，要按照一定标准喂养饲料，保证定时、定量和定位、定质，按照具体的营养需求科学配料，以促进饲料利用效率的提升。还要保证饲料养殖人员技术水平的提升，避免饲料浪费。科学喂养在能够降低生产成本的条件下，为实际的养殖工作提供更高的发展效益。

表2 各组体质量周变化情况比较（±s ，n = 9） g

表2 各组体质量周变化情况比较（±s ，n = 9） g

注：与db/dm 组比较，### P ＜0.001；与db/db 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周龄db/dm 组db/db 组DJC 组619.83±0.6533.03±1.03###32.49±1.05 721.16±1.3837.29±1.32###36.26±1.07 821.74±1.4539.80±2.85###37.31±1.81△922.41±1.9742.29±3.36###38.10±1.67△△1022.86±1.7943.80±4.84###39.31±2.38△△1123.29±1.7845.78±6.72###38.80±3.22△△1224.03±2.1347.58±7.80###38.58±3.94△△1324.44±1.9950.54±10.04###36.96±5.02△△△1425.33±1.9852.00±11.32###35.54±6.10△△△1525.90±1.5254.02±12.85###35.36±6.57△△△1626.53±2.0155.57±14.00###34.76±5.74△△△1726.69±1.8656.87±14.19###34.76±5.52△△△1826.99±1.6158.13±14.65###34.70±5.84△△△

3.2 各组摄食量周变化情况比较

见表3。

表3 各组摄食量周变化情况比较（±s ，n = 3） g

表3 各组摄食量周变化情况比较（±s ，n = 3） g

注：与db/dm 组比较，### P ＜0.001；与db/db 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周龄db/dm 组db/db 组DJC 组756.70±1.40112.70±6.13### 98.33±4.83△△868.00±1.81125.23±2.00### 107.37±11.82△971.23±1.90126.03±6.38### 99.33±5.53△△1074.00±1.30125.10±11.98### 101.43±6.60△1175.43±1.95125.33±8.40### 95.73±9.33△△1273.90±3.60115.63±6.61### 92.30±3.22△△1375.97±2.08124.70±3.40### 96.03±2.37△△△1474.83±2.50119.03±6.99### 102.83±2.87△△△1573.73±0.85119.60±2.05### 96.73±4.78△△△1671.03±1.81121.13±1.50### 96.97±1.14△△△1772.37±1.51125.23±2.29### 97.40±1.59△△△1871.67±1.27117.83±6.02### 95.03±1.48△△△

3.3 各组病理形态学变化情况比较

HE 染色显示，db/dm 组下丘脑病理改变不明显，细胞形态完整，间质血管无明显充血及出血现象；db/db 组可见大量细胞核深染、固缩且空泡化严重，胶质细胞增生侵蚀；DJC 组较db/db 组病理改变减轻，可见少量细胞核深染，少量空泡变性。见图1。

图1 各组病理形态学显微图（HE 染色，400x）

3.4 各组免疫组化及定量比较

除此以外，未来，货币政策仍需继续发力。业内人士表示，从央行三季度货币政策执行报告以及各方数据来看，市场流动性相对充裕，但金融机构的风险偏好仍偏低，放贷意愿不足，继续稳定融资、疏通货币政策传导机制已经并将持续成为下一步政策的重点。宋清辉认为，未来货币政策应该重点关注小微企业和“三农”领域等，并通过实施定向降准政策，保持流动性合理充裕。同时，货币政策方向应该朝民营企业倾斜，消除“梗阻”同时刺激金融市场对于民企的支持力度。

图2 各组免疫组化及定量图（400x）

表4 免疫组化定量数据（±s，n = 3）

表4 免疫组化定量数据（±s，n = 3）

注：与db/dm 组比较，## P ＜0.01；与db/db 组比较，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

项目db/dm 组db/db 组DJC 组α-MSH0.100 2±0.006 20.022 9±0.013 4##0.145 1±0.020 2△△△AgRP0.033 4±0.004 80.048 3±0.000 7##0.035 3±0.002 4△△

3.5 qRT-PCR

小鼠到达后经无菌通道进入SPF动物房检疫室，经1周适应性饲养后转移至小鼠专用饲养室层流架。转入层流架后禁食6 h 候采取尾尖采血快速检测血糖，db/db 小鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1时分入db/db 组及DJC 组，db/dm 组全部入组并检测空腹血糖以作对照。DJC 组按体表面积计算每只灌胃630 mg·kg-1·d-1[8]，db/db 组及db/dm 组按同质量每日灌胃纯净水。按种属随机分入饲养笼盒，每笼3 只小鼠。饲养周期为12 周。

表5 各组mRNA 相对表达量数据（±s ，n = 8）

表5 各组mRNA 相对表达量数据（±s ，n = 8）

注： 与db/dm 组比较，### P ＜0.001； 与db/db 组比较，△△△P ＜0.001

项目db/dm 组db/db 组DJC 组α-MSH 1.00±0.310.26±0.08###0.60±0.15△△△AgRP1.01±0.252.87±0.70###1.42±0.41△△△

3.6 ELISA

基于增加资源数量，提高资源质量，改善资源功能的逻辑，推动矿业供给侧改革。由煤、铁等大宗矿产的开采向稀土、钨、锂等新兴战略性、高技术矿产资源开采转变，将共伴生稀土矿、钨矿等纳入总量控制指标管理。推动非煤能源如天然气、地热、页岩气、煤层气等相对环保型资源的开发使用，优化资源使用结构。

表6 Elisa 检测定量数据（±s ）

表6 Elisa 检测定量数据（±s ）

注：与db/dm 组比较，### P ＜0.001；与db/db 组比较，△△△P ＜0.001

项目例数db/dm 组db/db 组DJC 组血清α-MSH/（μg·L-1）9 8.33±0.35 6.37±0.17### 7.40±0.22△△△血清AgRP/（pg·mL-1）9108.67±4.60182.84±10.39###141.41±8.46△△△下丘脑α-MSH/（μg·L-1）8 8.11±0.36 5.85±0.34### 6.98±0.16△△△下丘脑AgRP/（pg·mL-1）8100.75±4.94175.68±8.27###137.96±7.14△△△

4 讨论

在过去30 年里，全球糖尿病患者人数近乎增长了2 倍之多，因糖尿病引起的各种并发症导致的死亡，也排在人类死亡因素的第9 名[2]。我国糖尿病人群的患病率连年攀升，近年的数据显示我国糖尿病的患病人群已超过1.5 亿人[1]。这不但给患者及患者家属带来巨大经济及生活负担，也使得我国卫生健康防治压力急剧增高。

糖尿病作为一种患病率居高不下的疾病，自古以来便被多种书籍所记载。《素问·奇病论》记载：“帝曰：有病口甘者，病名为何？何以得之？岐伯曰：此五气之溢也，名曰脾瘅。夫五味入口，藏于胃，脾为之行其精气，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所发也。此人必数食甘美而多肥，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”此记述详细描绘了多食导致肥胖，而肥胖又引起脾瘅，进而发展为消渴的过程[9]。即不节制的饮食会引起人体肥胖，而肥胖会导致现代医学所说的糖尿病前期，进而会发展为糖尿病。

中医学将食欲亢进的病位定于胃，而又与心、肝、脾等脏器相关[10]。DJC 包含太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭六种中药颗粒。药理学研究表明，泽泻能够促进胰岛素受体底物1（Insulin Receptor Substrate-1，IRS-1）磷酸化，形成磷酸化的胰岛素受体底物1（phospho-IRS1，p-IRS1），从而降低血糖，减轻胰岛素抵抗[11]，同时，泽泻能够通过削弱游离脂肪酸的作用，从而减少肝细胞内三酰甘油和总胆固醇的沉积[12]，预防肥胖；太子参能够通过改善2 型糖尿病患者HIF-1α 及SIRT1 的表达，从而减轻胰岛素抵抗，减少脂肪沉积，发挥调节血糖及血脂的作用[13]；地黄所含地黄低聚糖能够降低db/db小鼠体内α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖[14]，抑制肝糖异生，减少三酰甘油的生成[15]；菟丝子能够经JAK-STAT 通路调节机体的糖脂代谢，降低胰岛素敏感性[16-17]；水蛭能够通过抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，Fas）等脂肪合成相关酶发挥作用，从而减少胆固醇和脂肪酸的合成，降低血脂[18]。

肥胖的本质是能量摄入与消耗之间的失衡[19]，过多的食物进入肠道后被分解为葡萄糖，以肝糖原的形式进行存储，糖酵解生成的磷酸二羟丙酮转化形成甘油，糖氧化分解生成的乙酰CoA 合成脂肪酸，进而形成脂肪存储于全身[20]。摄食行为的控制中枢位于下丘脑弓状核（Arcuate nucleus，ARC），该区域主要含有能够增强食欲的神经肽Y（Neuropeptide Y，NP-Y）和刺鼠相关肽（Agouti-related peptide，AgRP）以及抑制食欲的促阿片-黑素细胞皮质素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）[21]。其中AgRP与POMC 是一对相互拮抗的神经元物质，分别发挥着促进食欲和抑制食欲的作用[22]。脂肪细胞来源的瘦素（Leptin）与其长亚型瘦素受体[23]（leptin receptor long isoform， LepRb）结合后激活Janus 激酶 2（Janus Kinase 2，JAK2），形成磷酸化的Janus激酶 2（phospho-JAK2，p-JAK2），p-JAK2 又进一步激活STAT3，STAT3 的激活会使得IRS-1 磷酸化为p-IRS1，最终抑制刺激食欲的POMC 及其衍生物α-MSH 的生成并刺激增强食欲AgRP 的生成[24]。

例19中作者将“一带一路”受到欧洲各国的欢迎预设为既成事实，从而关闭了对话空间。从上下文看，例20中的“indeed”既强调了事实本身又透露出一种惊讶和嘲讽的态度。

db/db 小鼠作为一种leptin-R 缺失动物模型，能够在高保真情况下模拟肥胖症、2 型糖尿病等疾病的发生发展过程。STAT3 通路作为经典的瘦素通路，上游靶点leptin-R 的缺失导致瘦素无法与受体结合，进而影响下游通路的激活，最终使得STAT3 无法促进POMC 的分泌，进而POMC 衍生物α-MSH 的生成无法得到保证，同时也无法抑制AgRP 的分泌，形成了过多的AgRP，最终导致食欲的增高，并发生瘦素/胰岛素抵抗[25-26]。

课题组前期已经在GK 大鼠模型上证明DJC 能够提高胰岛素受体底物IRS1 的表达[27]，也能够提高SD 大鼠STAT3 的表达并促进其磷酸化[28]。本研究证实了DJC 能够促进下丘脑α-MSH 的分泌并抑制下丘脑AgRP 的分泌；也证实了db/db 小鼠相较其野生同型对照db/dm 小鼠，下丘脑存在更多的AgRP 蛋白且存在更少的α-MSH 蛋白，而这种趋势被DJC 所改善；同时，在mRNA 层面也观察到了相同的趋势，即db/db 小鼠较db/dm 小鼠含有更多的AgRP mRNA，更少的α-MSH mRNA，这种趋势同样被DJC 所改善；使用免疫组化方法进行的相关抗原定量得到了相同结果。以上这些结果与db/dm 组、db/db 组及DJC 组所表现出的体重趋势，进食趋势相符合。由此，我们认为DJC 能够通过促进α-MSH的表达并抑制AgRP 的表达来改善小鼠进食行为，减轻体质量，从而改善小鼠的肥胖状态，进而降低糖尿病的发生风险。