射干制剂对失眠大鼠自主活动及TLR7/MyD88 信号通路的影响

黄 赫，赵文嘉，赵 磊，王若冰，包玉龙，范英兰，张 瑜，张洪瀛，甘 雨，朱竟赫*

（1. 辽宁中医药大学附属第二医院医学检验中心，沈阳 110034；2. 辽宁省中医药研究院中药药理室，沈阳 110034；3. 辽宁省中医药研究院实验动物中心，沈阳 110034）

TLR（Toll-like receptor）是识别细菌、病毒等病原体的关键受体[1-2]。TLR7 是TLR 家族中识别单链病毒RNA（ssRNA）的关键成员[1-3]。TLR7 通过MyD88 依赖的途径激活NF-κB，触发趋化因子和炎症细胞因子，并激活TGF-β 活化激酶1（TAK1）、IL-1 受体相关激酶（IRAK）和TNF 受体相关因子6（TRAF6）[4]。TLR7/MyD88信号通路既参与免疫调节，又能通过调节细胞因子调节睡眠功能。失眠属于影响人类生理和心理健康的常见疾病，其病因可分为实证和虚证所致。中医常采用实则泻之，虚则补之的治则。射干具有泻火、解毒、散血、消痰之功效，可对抗实证失眠。前期研究结果显示，射干制剂具有戊巴比妥钠协同作用等，然而其作用机制不十分明确。本研究从泻火安神的角度，应用分子生物学、行为学测量系统、脑电图技术和数理统计等手段与方法探讨射干制剂对PCPA 所致失眠症的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，SPF 级，雌雄各半，体质量180 ～220 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。动物饲养于辽宁天一技术有限公司[动物使用许可证号：SYXK（辽）2020-0005]，环境温度21 ～25℃，相对湿度40%～70%。

1.2 药物与试剂

射干提取物由辽宁中医药大学附属第二医院药学实验室提供，每粒胶囊含内容物0.30 g，1 g 内容物相当于0.33 g 提取物（批号：20200402）；朱砂安神丸由北京御生堂集团石家庄制药有限公司提供（批号：141007）；地西泮片由上海上药信谊药厂有限公司生产（批号：1420060）。对氯苯丙氨酸（PCPA）由SIGMA 公司生产（批号：SHBD9168V）；动物组织总RNA 提取试剂盒（带gDNA 清除柱）（货号RE-03014）购自成都福际生物科技有限公司；罗氏SYBR GREEN 染料（货号4913914001）购自罗氏公司。

1.3 仪器设备

EthoVision 大小鼠行为学系统，由NOLUDS公司提供；JJ2000B 电子天平，由江苏常熟双杰电子天平有限公司生产；PL83-S 型天平，由梅特勒-托利多仪器有限公司生产；TD5A-WS 台式离心机，由长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；罗氏LightCycler480 实时定量PCR仪，由Roche公司生产；Thermo Scientific 台式高速冷冻离心机，由Thermo Scientific 公司生产。

1.4 射干提取物对大鼠自主活动的影响

各组在连续给药7 d，末次给药 1 h 后，放于自主活动箱内，摄像头记录其10 min 内自主活动录像，用75%酒精消毒除去自主活动箱内前1 个大鼠留下的气味，使各组之间不相互干扰，屋内保持安静。应用EthoVision 大小鼠行为学系统比较空白组、模型对照组、射干低剂量组、射干中剂量组、射干高剂量组、朱砂安神丸组、地西泮组的实验行为学指标，包括移动距离、移动时间、中心区频率等。

1.5 试剂盒提取大鼠脑组织mRNA

取新鲜组织每20 mg 左右加入500 µL Buffer RL1，使用玻璃匀浆器将组织研磨均匀；将研磨均匀的匀浆液转移至DNA 清洗柱（DNA-cleaning column）中，12 000 r·min-1（13 400×g）离心 2 min。移除DNA-Cleaning Column，保留收集管内上清液；向上述上清液（体积应约为 500 µL）中加入1.6倍体积 Buffer RL2（使用前请确认已按照说明加入无水乙醇），轻柔混匀；将700 µL 混合液转移至RNA-only Column 中（纯化柱放入收集管中），12 000 r·min-1（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液；将纯化柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入纯化柱中，12 000 r·min-1（13 400×g），离心1 min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入500 µL Buffer RW1，12 000 r·min-1（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入700 µL Buffer RW2（使用前请确认已按照说明加入无水乙醇），12 000 r·min-1（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，重复1 次；将纯化柱放回收集管中，12 000 r·min-1（13 400×g）空管离心2 min，去掉离心柱中残余的 Buffer RW2；将纯化柱转移至新的离心管中，向纯化柱的膜中央滴加50 µL 已于65 ℃预热的RNase-Free ddH2O（切勿将洗脱液添加到压圈上，否则会损失较大体积的洗脱液），室温放置2 min。12 000 r·min-1（13 400×g）离心1 min，收集RNA 溶液。为提高RNA产量，可将离心得到的 RNA 溶液重新加至纯化柱中，重复步骤1 次。

1.6 mRNA 反转录为cDNA 反应

5×PrimeScript Buffer（for Real Time）2.0 µL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 µL， Oligo dT Prime（50 µM）0.5 µL， Random 6 mers（100 µM）0.5 µL，Total RNA5 µL，RNase-Free ddH2O 1.5 µL，37℃15 min，85 ℃sec，4℃ +∞。

1.7 实时定量PCR 反应

FastStart Universal SYBR Green Master 25 µL，上游引物（10 µM）1.5 µL，下游引物（10 µM）1.5 µL，ddH2O 17 µL，cDNA 5 µL；50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles。利用各组目的基因的CT 值，以β-actin 为内参，用2-ΔΔCT 法计算各组目的基因的相对表达量。引物序列：RAT TLR7F：GGAAACTGCCCTCGATGTT；RAT TLR7R：CCTGGAGGTTGCTCATGTT；RAT MYD88F：GAAGCGACTGATCCCTATCAAG；RAT MYD88R：CAAGTCAGCTCATCTTCCTCTC；RAT ACTINF：TCCCTGGAGAAGAGCTATGAG；RAT ACTINR：TCCATACCCAGGAAGGAAG。

1.8 射干制剂对PCPA 致失眠大鼠脑电波的影响

经前期处理后的各组大鼠于第4 天开始给药，其中空白对照组给予同体积蒸馏水，持续给药7 d，在第6天经腹腔注射戊巴比妥钠建立失眠大鼠模型。末次给药后，无线电遥测系统技术记录戊巴比妥钠致失眠大鼠1 h 的脑电活动，应用脑电信号分析睡眠时相并计算各组大鼠α 波百分比、β 波百分比、θ波百分比和δ 波百分比。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计学处理，计量结果符合正态分布，数据用均数±标准差（±s）表示，不同时间点比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 射干制剂对大鼠行为学指标的影响

见表1、图1。

图1 各组热区图图像

表1 射干制剂对大鼠自主活动的影响（±s ，n = 10）

表1 射干制剂对大鼠自主活动的影响（±s ，n = 10）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别移动距离/cm移动速度/（cm·s-1）中心区频率/次 中心区累计持续时间/s 中心区第一次潜伏期/s空白对照组1 958.27±849.37 3.26±1.39 3.47±2.9011.59±20.66 75.13±51.38模型对照组5 521.87±3 038.21## 9.18±5.11##23.88±12.79##12.12±15.23 37.36±28.18射干制剂低剂量组 3 810.76±1 787.42 6.43±3.0219.82±17.55 8.66±14.13 98.80±89.28射干制剂中剂量组 5 789.93±1 977.4310.02±3.9036.73±18.8715.88±17.83 86.91±92.87射干制剂高剂量组 3 272.63±793.58△ 5.42±1.59△12.39±6.02△20.53±24.16106.17±138.05朱砂安神丸组3 083.57±675.58△ 5.22±1.73△ 5.03±6.12△△10.05±16.02181.45±166.22△地西泮片组3 137.83±762.13△ 5.53±1.08△10.02±6.24△23.78±15.25 67.35±60.23

1.1 射干制剂对大鼠脑组织TLR7、MyD88 mRNA表达的影响

见表2。

表2 射干制剂对大鼠脑组织TLR7、MyD88 mRNA 表达的影响（±s，n = 10）

表2 射干制剂对大鼠脑组织TLR7、MyD88 mRNA 表达的影响（±s，n = 10）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

My D88 基因相对表达量空白对照组3.47±0.27 0.51±0.13模型对照组6.39±0.66 ##1.17±0.32 ##射干制剂低剂量组6.10±0.28△ 1.02±0.25△射干制剂中剂量组5.91±0.35△ 0.95±0.51△射干制剂高剂量组5.81±0.38△△0.83±0.18△△朱砂安神丸组4.11±0.62△△0.80±0.31△△地西泮片组3.84±0.16△△0.77±0.17△△组别TLR7 基因相对表达量

2.3 射干制剂对大鼠脑电波百分比的影响

见表3。

表3 射干制剂对大鼠脑电波百分比的影响（±s ，n = 10）

表3 射干制剂对大鼠脑电波百分比的影响（±s ，n = 10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05

组别时间点/minδ 波/%θ 波/%α 波/%β 波/%空白对照组600.59±0.700.38±0.240.88±0.481.51±0.74模型对照组600.65±0.36#0.62±0.301.51±0.603.10±1.59射干制剂低剂量组600.91±0.53△0.59±0.211.42±1.572.71±0.89射干制剂中剂量组601.09±0.79△0.65±0.301.42±0.693.13±1.58射干制剂高剂量组600.68±0.810.60±0.311.12±0.482.67±1.13朱砂安神丸组601.49±1.43△0.58±0.311.47±0.652.53±0.92地西泮片组601.25±0.89△0.71±1.431.88±1.103.81±2.75

3 讨论

失眠的特征是难以开始睡眠、维持睡眠或清晨醒来，并伴有日间睡眠障碍。越来越多的证据[5-8]表明，失眠与一系列负面的健康后果相关，如精神障碍、心血管功能障碍、2型糖尿病和肥胖型等多因素相关。射干的散血、消痰之功效，可对抗实证失眠。本研究利用PCPA 诱导的大鼠模型，探讨射干制剂对失眠的改善作用和分子机制。PCPA 造模后大鼠兴奋度增高、白天活动量大，提示造模成功。Etho Vision大小鼠行为学系统详细病理方面尚不清楚[9]。本次自主活动结果和热区图图像结果显示，射干制剂组、朱砂安神丸组及地西泮片组自主活动减少、兴奋性受到抑制、睡眠/觉醒周期得到调节。朱砂安神丸组在中心区第一次潜伏期增多，与朱砂安神丸有显著的安神效果相符合。

Toll样受体（TLRs）是一种重要的模式识别受体，它可以识别病原体特定分子群中的高阶结构模式。除了免疫之外，不同的TLR 和TLR 相关信号分子被认为有助于哺乳动物中枢神经系统的发育和可塑性[10]。MyD88 是一种在细胞内传递或桥接TLR介导的信号的适配器分子。MyD88 对于TLRs 配体触发的细胞内级联反应至关重要，它释放促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β 和其他促炎因子，如一氧化氮、环氧合酶、前列腺素E2 和三磷酸腺苷，其中大多数已被发现调节睡眠/觉醒周期时间[11]。据报道[1]，有些中药通过调节TLR7/MyD88 信号通路抑制炎症反应而发挥对流感病毒引起的急性肺损伤的体内保护作用。此外，TLR7/MyD88 信号通路也由于其免疫调节作用而作为SLE 的治疗靶点[12]。敲除多个TLRs 和信号因子的实验[13]证明了TLR7 在SARSCoV-2 感染诱导的炎症信号中至关重要。TLR7/MyD88 信号通路在炎症反应和免疫调节方面发挥重要作用。综上所述，TLR7/MyD88 信号通路可能在调节失眠大鼠睡眠/觉醒周期方面有着重要意义。

本研究实时定量PCR 结果显示，模型对照组与空白对照组相比，脑组织TLR7、My D88 相对表达量显著升高，说明造模成功；同模型对照组相比，射干制剂低剂量组、射干制剂中剂量组TLR7、MyD88 mRNA 表达量均降低（P＜0.05），其中射干制剂高剂量组TLR7、 MyD88 的mRNA 表达量显著降低（P＜0.01），推测无论是射干制剂、朱砂安神丸还是地西泮可能通过调节TLR7、MyD88 mRNA 表达从而改善睡眠，其中射干制剂高剂量组改善大鼠睡眠的改善最明显。大鼠脑电图结果显示，低中剂量的射干制剂、朱砂安神丸和地西泮片可能是通过增加脑电图δ 波百分比以改善大鼠睡眠。

综上所述，射干制剂可调节失眠大鼠的睡眠/觉醒周期和增加脑电图δ 波百分比来改善睡眠；且此作用可能是通过调节脑组织TLR7、MyD88 基因的表达发挥作用，其中射干制剂高剂量组疗效最好。探讨射干制剂的抗失眠药效作用机制可初步阐明其所调控的网络，以期找到明确药效对应的作用靶点，为抗失眠新药研发提供支撑。