9周负重爬梯训练对绝经后骨质疏松症大鼠的影响及作用机制分析

2024-01-23黄兴裕张帅军

山东体育学院学报 2023年6期

黄兴裕,梅赞,张帅军

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于卵巢功能衰退引发的代谢性骨病[1],属原发性骨质疏松症最常见的类型,严重影响着中老年女性的身心健康。药物是缓解和治疗PMOP的最有效措施,但长期服用有副作用。Hedgehog-Gli通路是生物体的一条重要信号通路,由Hedgehog(Hh)蛋白、Ptched (Ptc)、Smoothened (Smo)受体、Gli转录因子及下游靶基因组成,参与多种类型细胞的分化、增殖和器官的发育,在胚胎发育和组织稳态中具有重要作用。近年来的研究表明,Hedgehog-Gli信号通路在骨发生、发育和生长中扮演着重要角色,其受体和关键因子的激活或过表达可以促进骨形成,而阻断该通路可以导致骨形成的能力下降[2]。运动是骨健康促进的一种有效手段,在骨质疏松的临床管理和骨折预防中扮演着重要的角色[3]。文献研究发现,国内外鲜有抗阻运动是否能够通过Hedgehog 信号通路改善绝经后大鼠骨质疏松发生发展的研究报道。因此,本研究通过建立PMOP大鼠模型,观察负重爬梯训练对去势大鼠骨的作用以及对Hedgehog-Gli信号通路相关因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

采用试剂包括:碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨钙素(osteocalcin,OC)试剂盒(上海江菜生物有限公司);核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司);Shh、Ihh、Ptc、Smo试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

1.2 仪器与设备

使用仪器和设备包括:InAlyzer小型动物双能X射线仪(深圳柏安诺科技有限公司)、KW-GU小动物骨骼强度测试仪(南京卡尔文生物科技有限公司)、LD-96A型全自动生化分析仪、荧光定量PCR仪(山东莱恩德智能科技有限公司)、DYCZ-40K型转印电泳仪和WD-9413B型凝胶成像分析系统(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组与建模

适应性喂养1周后,采用随机数法将40只大鼠分为假手术组(S,8只)和手术组(O,32只)。参照去势法[4]造模,S组仅切除卵巢周围脂肪组织,O组摘除卵巢,期间有2只大鼠死亡。术后2个月末,依据世界卫生组织推荐的绝经后骨质疏松大鼠模型的研究标准,从O组随机选取6只进行骨小梁和骨密度检测,结果显示,骨小梁稀疏,形态结构完整性差,骨陷窝间隙增大,骨细胞减少,密度降低,说明建模成功。再将成功建模的大鼠随机分为模型组(M)、戊酸雌二醇阳性对照组(P)和负重爬梯组(R),每组8只。

1.3.2 给药与运动

1.4 指标检测

1.4.1 取材

1.4.2 骨密度的检测

取待测股骨,PBS清洗后在双能X射线仪上检测不同区段的骨密度值。

1.4.3 血清骨代谢指标的检测

取全血,以2 000 r/min转速离心10 min,分离血清,在生化分析仪上检测血清中ALP、RANKL、OPG、OC等的代谢物水平。

1.4.4 骨力学性能的检测

将股骨的前、中、末端依次置于材料试验机上,采用三点弯曲实验法,加载速度2 mm/min,跨距20 mm,记录载荷-变形曲线,换算最大载荷、弹性载荷和破坏载荷等指标强度。

1.4.5 Hedgehog-Gli信号通路相关因子蛋白表达的检测

1.4.6 Hedgehog-Gli信号通路相关因子基因表达的检测

RT-PCR法[8]:Trizol法提取总RNA,利用反转录试剂盒将RNA逆转录为单链cDNA。参照陈祥和等[9]设计的基因引物序列(见表1),按试剂盒说明,反应条件为95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,共40个循环,在PCR仪上检测Hedgehog-Gli信号通路相关因子基因的表达。以β-actin作为内参,计算相对量,以2-ΔΔCt法分析。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.5 数据处理与分析

2 实验结果与分析

2.1 各组大鼠骨密度的检测

大鼠股骨不同部位的骨密度显示,与S组相比,M组股骨不同部位的骨密度值降低(P<0.01)。与M组相比,P组和R组股骨不同部位的骨密度值升高(P<0.01)。与P组相比,R组股骨不同部位的骨密度降低,但差异没有统计学意义(P>0.05)。上述研究说明负重爬梯能够增加骨质疏松大鼠的骨量,提升骨密度(见表2)。

表2 各组大鼠股骨区域性骨密度值表

2.2 各组大鼠血清骨代谢指标的检测

大鼠血清骨代谢指标显示,与S组相比,M组ALP3、RANKL水平升高(P<0.01),OC、OPG水平降低(P<0.01)。与M组相比,P组和R组ALP3、RANKL水平降低(P<0.01),OC、OPG含量升高(P<0.01)。与P组相比,R组ALP3、RANKL水平升高(P<0.05),OC、OPG水平降低(P<0.05)。上述研究说明负重爬梯能够调节骨质疏松大鼠的骨代谢(见表3)。

表3 各组大鼠血清骨代谢指标水平表

2.3 各组大鼠骨力学性能指标的检测

大鼠股骨力学性能结果显示,与S组比较,M组最大载荷、弹性载荷和破坏载荷各指标下降(P<0.01)。与M组比较,P组和R组最大载荷、弹性载荷和破坏载荷各指标升高(P<0.01)。与P组相比,R组最大载荷、弹性载荷和破坏载荷各指标升高,但差异没有统计学意义(P>0.05)。上述研究说明负重爬梯能够提升骨质疏松大鼠骨的抗压、抗弯和抗扭曲能力(见表4)。

表4 各组大鼠骨力学性能水平表

2.4 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子蛋白表达的检测

Hedgehog-Gli信号通路Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli蛋白表达结果显示,与S组相比,M组蛋白表达降低(P<0.01)。与M组相比,P组和R组蛋白表达升高(P<0.01)。与P组相比,R组蛋白表达升高(P<0.05)。上述研究说明负重爬梯能够上调Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli蛋白的表达(见表5和图1)。

表5 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子蛋白的表达表

图1 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子蛋白的表达图Figure 1 Expression of Hedgehog-Gli pathway related factor protein in rats in each group 注:A. Western blotting检测结果;B. Western blotting检测半定量分析结果。

2.5 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子基因表达的检测

Hedgehog-Gli通路Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli 基因表达结果显示,与S组相比,M组mRNA表达下降(P<0.01)。与M组相比,P组和R组mRNA表达升高(P<0.01)。与P组相比,R组mRNA表达升高(P<0.05)。上述说明负重爬梯能够上调Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli基因的表达(见表6和图2)。

表6 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子mRNA的表达

图2 各组大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相关因子mRNA表达图Figure 2 mRNA expression of Hedgehog-Gli pathway related factors in rats in each group

3 讨论

3.1 9周负重爬梯训练对绝经后骨质疏松症大鼠骨密度的影响

骨密度在骨质疏松临床诊断和治疗效果评价中具有重要意义。随着年龄的增长,骨质的丢失,骨密度逐渐下降。夏梦嘉等[10]的研究指出,女性绝经后普遍存在骨密度降低的现象;Rathnayake等[11]的研究指出,女性绝经后的骨密度与骨质疏松的发生率具有负相关性。本研究中,M组骨密度显著下降,提示雌激素在维持女性骨密度方面具有积极的作用。运动在维持骨密度稳定方面具有积极的作用,持续规律运动对绝经后女性骨密度水平具有积极的改善作用[12]。本研究中,负重爬梯训练能够显著提升骨密度,其作用除了与应力有关外,还可能与Hedgehog-Gli信号通路有关。陈祥和等[9]的研究发现,运动训练可上调小鼠Ihh、Shh的mRNA表达,进一步激活Hedgehog-Gli信号通路;Levi等[13]的研究表明,激活的Hedgehog-Gli信号通路可上调促骨形成因子的表达,提高成骨细胞活性;成骨活性提高,可促使成骨细胞合成分泌的Ⅰ型胶原蛋白增加,促进矿质沉积,增加骨密度[14]。本研究中,R组Shh、Ihh表达水平最高,说明负重爬梯训练能够激活Hedgehog-Gli信号通路提升成骨活性,促进矿物质的沉积,维持骨密度。

3.2 9周负重爬梯训练对绝经后骨质疏松症大鼠骨代谢的影响

骨代谢指标能够及时反映骨转换的状态。根据骨代谢生化指标临床应用专家的共识[15],以OC、OPG作为骨形成标志物,RANKL、ALP3作为骨吸收标志物。生理状态下,成骨细胞和破骨细胞调控骨的形成和吸收,通过骨的改建和重建,维持骨量动态平衡。本研究中,M组血清ALP、RANKL水平升高,OC、OPG水平降低,提示骨质疏松状态下破骨细胞活性增强,骨吸收增加。运动是调节骨代谢平衡的重要措施之一。陈彤丹等[16]的研究指出,运动有助于降低骨转换水平,提升血清25-羟基维生素D,促进骨形成。本研究中,R组血清成骨细胞合成蛋白增多,破骨细胞分化因子下降,说明负重爬梯训练能够调节骨代谢,其作用可能与负重爬梯训练对骨面应力的高冲量有关。有研究[17]显示,高冲量的机械力能够上调骨LKBI蛋白;LKBI蛋白可激活Hedgehog信号通路,上调Shh的表达[18];而Shh在骨髓间充质干细胞向成骨分化中具有显著的正向调控作用[19]。本研究中,R组Shh表达显著升高,说明负重爬梯训练可激活Hedgehog-Gli信号通路上调Shh的表达,调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,促进成骨细胞的生成。

3.3 9周负重爬梯训练对绝经后骨质疏松症大鼠骨力学性能的影响

骨力学性能是骨内在质量和结构的综合表现,受年龄、健康状况以及运动等的影响。绝经后,雌激素水平显著下降,导致骨代谢紊乱,引发骨量减少、骨组织微结构退化。本研究中,M组最大载荷、弹性载荷和破坏载荷能力显著下降,提示骨抗压、抗弯和抗扭曲等性能下降,骨折易发风险上升,说明雌激素在骨结构维持方面具有重要的作用。运动能够改善骨结构,提升骨的强度和韧性。马涛[20]的研究指出,跑台训练能够抑制骨吸收,改善骨结构。Lauren等[21]的研究显示,蹦床运动能够改善骨结构,增强骨强度。肌肉力量也是决定骨强度的重要因素,肌张力能够通过Hedgehog信号通路促进骨的形成。Carbone等[22]通过对大鼠行屈肌肌腱前交叉韧带重建模型后,给予10 N的预张力干预,发现Ihh蛋白及下游Gli、Ptc蛋白表达增加,同时,应用Hedgehog信号通路阻断剂可使骨形成受损,提示Hedgehog信号通路与骨结构发生方面有一定的关联。本研究中,R组最大载荷、弹性载荷和破坏载荷能力显著提升,Shh、Ihh、Smo、Gli表达显著升高,说明负重爬梯训练能够通过Hedgehog信号通路介导Ihh、Gli、Ptc蛋白的表达,促进骨的形成,改善骨结构。

3.4 9周负重爬梯训练改善绝经后骨质疏松症的作用机制

运动作为一种应激源,在细胞信号分子及细胞信号转导途径中具有重要的作用。本研究中,负重爬梯训练能够增加矿物质沉积,维持骨密度、促进成骨细胞分化、增殖和成熟,进而改善骨的结构,其作用可能与激活Hedgehog-Gli信号通路有关。抗张应力刺激作用于骨膜表层小动脉外部骨形成细胞的原纤毛,可激活Cilia[23],活化的Cilia能够触发Hh蛋白N-末端发生变构,激活Hh蛋白,活化的Shh、Ihh与细胞膜上Ptc受体结合形成受体复合物,受体复合物可移位到胞浆与囊泡结合,触发囊泡里激活性受体Smo的抑制解除,Smo以一种未激活的构象出泡云集到胞膜上,其N-末端胞外域上的半胱氨酸富集区共价结合成二聚体,激活构象形态,活化的Smo与胞膜上的Kif7结合,泛素连接酶水解,引起Kif7、Fu、Sufu形成的复合物变构,触发Gli从胞浆中逸出来,Gli结构蛋白C-末端的转录激活域变构成转录激活子GliA,GliA与下游蛋白结合,通过骨髓间充质干细胞调控成骨细胞的增殖、分化及活性,改善骨质疏松。