补肾益智方对SAMP8小鼠海马α-Syn和PSD-95表达的影响

张彩霞 周泰冰 接琳琳 卢强 于海 吴君

(山东中医药高等专科学校,山东 烟台 264199)

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,中老年群体最常见,主要表现为学习认知障碍和行为改变,严重影响中老年人的生活质量〔1〕。随着全球人口老龄化的加剧,预计到2050年AD患者将达到1.154亿〔2〕,因此迫切需要对AD进行有效干预和治疗。中医认为AD认知障碍主要与肾虚髓亏、痰蒙脑窍有关,故中医治疗AD常用具有益精填髓、豁痰开窍功效的补肾类中药复方〔3〕。补肾益智方是由枸杞子、山茱萸、益智仁、石菖蒲等组成的中药复方,临床试验和动物实验均表明,补肾益智方可通过影响突触可塑性、神经炎症、神经元分化与凋亡等方面,进而改善记忆障碍,而且副作用较少〔4,5〕。前期实验室水迷宫实验表明,补肾益智方能显著提高AD模型鼠学习记忆能力〔6〕。本研究中通过观察补肾益智方对 7月龄SAMP8 小鼠海马内α-突触核蛋白(Syn)和PSD-95表达的影响,探讨其改善AD认知功能的机制,为补肾益智方在中医辨治AD治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 7月龄雄性快速老化模型鼠SAMP8,108只,同月龄SAMR1正常老化小鼠,雄性,36只,均购自北京华阜康生物科技有限公司,动物许可证号 SCXK(京)2019-0008,SPF级。

1.2实验药物 补肾益智方组成:熟地黄15 g、枸杞子20 g、益智仁6 g、山茱萸12 g、当归10 g、丹参15 g、石菖蒲10 g、郁金10 g等,以上药物经山东天江药业制成免煎颗粒。补肾益智方剂量设定根据成人的临床给药剂量 1.34 g/(kg·d)的2倍、4倍确立〔7〕,低、高剂量补肾益智方药液终浓度分别为2.68、5.36 g/(kg·d)。

1.3实验试剂 兔抗PSD-95多克隆抗体(ab238-135),鼠抗α-Syn多克隆抗体(ab1903)和兔抗Nestin多克隆抗体(ab221660)购自Abcam公司;荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)标记的羊抗兔IgG(111-095-003)和TRITC标记的羊抗小鼠IgG(115-025-062)购自美国Jackson Immuno Research。

1.4分组、给药与取材 随机将SAMP8小鼠分为模型组、补肾益智方低、高剂量组。对照组为同月龄SAMR1小鼠。补肾益智方低、高剂量组分别给予相应剂量药液灌胃,模型组和对照组均给予等量生理盐水灌服。连续灌胃42 d。水合氯醛麻醉。一部分用4%多聚甲醛经心脏灌流固定,剥离小鼠大脑,常规制作石蜡切片,进行免疫荧光染色。另一部分置于冰上迅速剥离小鼠脑组织,进行Real-Time聚合酶链反应(PCR)和Western印迹检测。

1.5免疫荧光染色 切片脱蜡,抗原修复,内源性过氧化物酶封闭;1%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃孵育35 min。甩掉血清,分别滴加一抗(兔抗PSD-95 1∶200或鼠抗α-Syn 1∶200),4 ℃孵育过夜。滴加二抗(FITC标记的羊抗兔IgG 1∶400或TRITC标记的羊抗小鼠IgG 1∶400),37 ℃避光孵育50 min;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液染细胞核,封片。免疫荧光双标记染色一抗为鼠抗α-Syn(1∶200)分别与兔抗PSD-95(1∶200)或兔抗Nestin(1∶500)的混合液,二抗为FITC标记的羊抗兔IgG(1∶400)和TRITC标记的羊抗小鼠IgG(1∶400)混合液,其他步骤相同。激光共聚焦显微镜观察、摄片。

1.6Real-Time PCR 参照Zhou等〔8〕提取总RNA实验步骤,提取总RNA,测定RNA浓度和纯度,逆转录反应合成cDNA,进行Real-Time PCR实验。引物序列:α-Syn上游:5′-CGTACAAGTGCTCAGTTCCAAT-3′,下游:5′-CCACAACAATATCCACAGCACA-3′;PSD-95上游:5′-ATGATCTTCTCTCCGAGTTCCC-3′,下游:5′-GAGGAGACAAGTGGTAATCGC-3′;GAPDH上游:5′-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3′,下游:5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′。

1.7Western印迹检测 提取海马组织总蛋白。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶,上样,电泳,转膜,5%脱脂奶粉溶液室温封闭60 min;4 ℃一抗孵育过夜;羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃摇床孵育55 min;电化学发光(ECL)反应3 min,暗室胶片曝光。

1.8统计学处理 采用ImageJ图像软件分别测量连续免疫荧光图片α-Syn、PSD-95和Nestin阳性细胞平均光密度值和Western印迹条带光密度值,采用SPSS20.0软件进行统计分析。

2 结 果

2.1α-Syn定位于海马区且在补肾益智方灌胃后表达降低 免疫荧光结果显示,灌胃6 w后,各组海马齿状回、CA2和CA3区中均可检测到大量的α-Syn阳性表达,呈点状密集分布。与对照组比较,模型组海马区α-Syn平均光密度值显著升高(P<0.01)。与模型组比较,补肾益智方低、高剂量组海马区α-Syn平均光密度值均显著降低(P<0.05,P<0.01)。与补肾益智方低剂量组相比,补肾益智方高剂量组海马区α-Syn平均光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。Real-Time PCR和Western印迹结果显示,与对照组比较,模型组海马α-Syn mRNA和蛋白水平显著更高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,补肾益智方低、高剂量组海马α-Syn mRNA和蛋白水平中显著降低(P<0.05,P<0.01)。与补肾益智方低剂量组相比,补肾益智方高剂量组海马α-Syn mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1、图2。

图1 各组海马区齿状回α-Syn(免疫荧光染色,×400)

表1 各组海马区α-Syn、PSD-95和Nestin 免疫阳性细胞平均光密度值及α-Syn、PSD-95 mRNA比较

图2 各组海马区α-Syn-PSD-95双标记染色(免疫荧光染色,×400)

2.2α-Syn-PSD-95和α-Syn-Nestin免疫荧光双标记检测 α-Syn-PSD-95免疫荧光双标记实验表明:α-Syn主要表达于突触结构。海马齿状回区,α-Syn分别密集分布于PSD-95阳性细胞和Nestin阳性细胞周边。在CA1、CA2和CA3区,α-Syn主要分布于PSD-95阳性细胞一侧。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马齿状回中Nestin平均光密度值均显著增强(P<0.01)。见表1,图2～4。

图3 各组海马CA3区α-Syn-Nestin双标记染色(免疫荧光染色,×400)

2.3PSD-95定位于海马区且补肾益智方灌胃后表达升高 免疫荧光结果显示,补肾益智方灌胃42 d后,各组海马齿状回和CA区中均可检测到PSD-95阳性细胞。与对照组比较,模型组海马中PSD-95平均光密度值显著降低(P<0.01)。与模型组比较,补肾益智方低、高剂量组海马PSD-95平均光密度值均显著增强(P<0.01)。与补肾益智方低剂量组相比,补肾益智方高剂量组海马PSD-95平均光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。

Real-Time PCR和Western印迹结果显示,与对照组比较,模型组海马PSD-95 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,PSD-95 mRNA和蛋白水平在补肾益智方低、高剂量组海马中均显著升高(P<0.01,P<0.05)。与补肾益智方低剂量组相比,补肾益智方高剂量组海马PSD-95 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1,图5,图6。

图4 各组海马CA2区α-Syn-Nestin双标记染色(免疫荧光染色,×400)

图6 Western印迹检测各组海马PSD-95和α-Syn 蛋白水平

3 讨 论

AD 的病因基础是肾虚髓亏,关键因素是痰、瘀共为浊邪,中医常以“肾-髓-脑”为轴线,以补肾为先的理念论治AD,临床已取得满意疗效〔9〕。补肾益智方中熟地黄、枸杞子、山茱萸可补肾填精,石菖蒲、当归、郁金和远志可化痰湿,散瘀血,气血通行流利臻于和平,诸药合用具有补肾健脑、活血益气、开窍醒神的功效,恰好解决了 AD 本虚标实的病机特点〔10〕。临床实践证明,补肾益智方在老年遗忘型轻度认知功能障碍方面有疗效〔11〕。实验发现补肾益智方能有效改善6月龄SAMP8小鼠的学习和记忆能力〔12〕。越来越多的证据表明,突触的变化和丢失是导致AD认知损伤最早最重要的病理原因〔13〕。海马作为人体记忆和认知功能中枢,其神经元再生的减少和突触形态结构、数量及功能状态改变是AD早期学习和认知障碍的基础〔14〕。

α-Syn是在突触前成分中广泛表达的一种可溶性神经元蛋白,有调节突触囊泡运输,维持神经元细胞膜稳态及调控多巴胺合成等作用〔15〕。Singh等〔16〕发现A53T α-Syn 转基因鼠突触后功能障碍和突触可塑性异常,导致记忆和认知功能障碍。其机制一方面是由于α-Syn阻止突触囊泡的形成,导致神经递质释放减少和细胞膜的通透性增加,引起Ca2+内流和兴奋性毒性,神经元功能障碍甚至死亡〔17〕。另一方面,α-Syn寡聚体可通过降低微管的稳定性,破坏肌动蛋白和微管之间的相互作用,轴浆运输减少,进而降低了突触小泡的转运功能及抑制微管蛋白的聚合作用〔18〕。本实验与Singh等〔16〕结果一致。这可能是因为可溶性的α-Syn过度表达时,聚集形成可溶性的毒性寡聚体,进而降低SYN参与突触传递效能的调控,影响突触重塑和认知,导致记忆障碍〔19〕。另外,α-Syn与Tau和β-淀粉样蛋白(Aβ)分子之间关系密切,表达水平彼此影响,导致AD认知功能损伤〔20〕。PSD-95是一种重要的成熟谷氨酸能突触蛋白,有促进突触前成分成熟,维持突触后成分结构稳定,调节突触可塑性和增加树突棘数目和稳定性的作用,是检测突触重建水平的重要标志〔21〕。实验证明,敲除PSD-95会阻碍钙离子信号传导,进而影响空间学习和记忆能力〔22〕。本实验与Van Guilder 等〔23〕发现,PSD-95 随着年龄增长表达逐渐下降的研究结果一致。结合PSD-95在稳定突触可塑性方面的重要作用,推测SAMP8小鼠海马区 PSD-95 表达下降可能与其记忆功能减退有关。

本实验结果表明,补肾益智方通过影响α-Syn水平,有可能改善突触前成分的结构与功能,进而影响突触的可塑性和认知。本文补肾益智方低剂量组和高剂量组PSD-95 mRNA和蛋白量与模型组比较均显著升高,这可能与稳定突触连接,改善相关信号传递的功能有关。Jiao等〔24〕发现,敲除Tau基因能够破坏PSD-95途径,进而使α-Syn聚合体增加,导致神经元变性和功能异常。另外,也发现补肾益智方灌胃的SAMP8小鼠海马区α-Syn表达降低时Nestin表达增高。这可能因为在AD中,α-Syn可通过激活Toll样受体通路,破坏突触功能和促进神经元死亡导致记忆障碍〔25〕,补肾益智方灌胃后可降低小鼠海马α-Syn表达,进而增强海马内源性神经干细胞的增殖和突触重塑。本文结果显示,与补肾益智方低剂量组相比较,高剂量组海马中α-Syn、PSD-95和Nestin平均光密度值、mRNA和蛋白量未发现明显变化,其原因可能与实验动物月龄或所选药物剂量等因素有关。

综上,补肾益智方通过影响α-Syn、PSD-95和Nestin表达,调节突触可塑性和神经干细胞的增殖,进而改善SAMP8小鼠学习和记忆功能,但其具体的作用机制仍需要研究探讨。