夏枯草硫酸多糖下调miR-886-5p对肺结核模型大鼠的干预效果及作用机制

蒋琳华 陈秀琴 王瑜伟

(重庆市中医院检验科 川渝共建感染性疾病中西医结合诊治重庆市重点实验室,重庆 400021)

肺结核是慢性肺部传染病,患病者通常会出现咳痰、咳血、咳嗽、胸闷等症状。感染结核分歧杆菌是基本病因,可通过患病者飞沫传染,是否感染还取决于人体免疫、结核分枝杆菌数量、毒力有关,老年人发病率较高,能诱发全身多器官病变〔1,2〕。miR-886-5p可通过靶作用于程序性细胞死亡而调节免疫反应〔3〕。氨基转移酶(ALT)主要存在于各细胞中,肝细胞中最多。谷草转氨酶(AST)主要分布在肝脏、心肌等组织,是肝脏检查的常用指标。肿瘤坏死因子(TNF)-α主要由巨噬细胞分泌,可促进T细胞产生炎症因子。白细胞介素(IL)-6是种功能广泛的多效性细胞因子,有调节免疫答应的作用〔4〕。有研究发现,转化生长因子(TGF)-β1/Smad3信号通路参与了肺结核病变的发展〔5〕。另有研究发现,夏枯草硫酸多糖可缓解大鼠肝纤维化程度,在抗肿瘤中有重要意义〔6〕。夏枯草硫酸多糖有抗氧化、免疫调节功能及抗病毒的作用〔7〕。由于目前,临床治疗手段不甚理想,且夏枯草硫酸多糖对肺结核干预的研究较少,因此,本研究探究夏枯草硫酸多糖下调miR-886-5p对肺结核模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 对象与方法

1.1研究动物 选取50只6～8周龄的SPE级Wistar大鼠,体质量160～210 g,由广东至远生物提供,动物许可证号:SYXK(粤)2021-0251,大鼠饲养于恒温25 ℃,相对湿度为40%～60%的环境中。本次试验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定,且经医院伦理委员会批准同意。

1.2分组与建模 大鼠随机选取10只为正常组,其余40只参照江叶舟等〔8〕研究建立肺结核模型作为建模大鼠,正常组给予普通饲料喂养,肺结核模型组给予高脂饲料(蛋白质20%,脂肪30%,碳水化合物50%)喂养,喂养4 w后每组随机抽样2只,取肺组织苏木素-伊红(HE)染色,发现肺组织可见大量炎性细胞浸润为建模成功。建模成功后将肺结核模型组剩余的38只大鼠分为模型组(14只)、低剂量组(12只)、高剂量组(12只)。

1.3给药干预 给予上述处理10 w后,于第11周开始给药。低剂量组给予夏枯草硫酸多糖60 mg/kg,每4 d 1次,共3次。高剂量组给予夏枯草硫酸多糖100 mg/kg,每4 d 1次,共3次。正常组和模型组给予等量的生理盐水。以上各组均连续灌胃2 w。

1.4病理形态学观察 采血后取肺组织进行脱水、透明、包埋、制备横切面石蜡切片,做HE染色,光镜下观察肺组织的病理形态改变。

1.5miR-886-5p水平检测 miR-886-5p检测采用ABI3500荧光定量PCR仪,反射条件为90 ℃ 10 min,变性15 s,63 ℃退火15 s,75 ℃延伸15 s,40个循环,延伸阶段进行荧光检测,计算出miR-886-5p表达水平,重复实验5次。

1.6ALT、AST、TNF-α、IL-6水平检测 抽取各组大鼠主动脉血5 ml,离心处理(离心半径3 cm,转速2 000 r/min,离心时间15 min),分离血清。通过酶联免疫吸附试验对ALT、AST、TNF-α、IL-6水平检测,试剂盒由上海优利科生命科学有限公司(产品规格:48T/96T,货号:YLK-E1138),重复实验5次。

1.7肺组织中TGF-β1/Smad3信号通路蛋白测定 通过Western印迹对肺组织中的TGF-β1/Smad3信号通路蛋白TGF-β1、Smad3表达量进行检测,加裂解液,离心,分离血清,二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度,变性后,等量蛋白上样,经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、5%脱脂奶粉常温静置1 h,加入1∶1 000 TGF-β1、1∶1 000 Smad3的一抗,4 ℃孵育12 h,加入相应的1∶10 000二抗,常温孵育2 h,使用凝胶成像系统分析数据,以GAPDH为内参照,定量分析蛋白表达情况。二抗由北京百奥莱博科技有限公司(货号:K28002)提供,重复实验5次。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1肺结核模型的判定 如图1所示,造模后病理切片显示,正常组肺组织形态正常,结构均匀,未见炎性细胞浸润;肺结核模型组有大量细胞变性,严重的炎性充血、水肿,大量炎性细胞浸润;提示造模成功。

图1 两组光镜下肺组织病理(HE染色,×400)

2.2病理特征比较 如图2所示,正常组肺组织形态正常,结构均匀,无炎性细胞浸润;模型组肺组织有大量细胞变性,严重的水肿,大量炎性细胞浸润;低剂量组肺组织病变减轻,炎性细胞浸润明显减少;高剂量组肺组织形态基本正常,轻微炎性细胞浸润。

图2 各组肺组织病理特征(HE染色,×400)

2.3各组miR-886-5p表达水平比较 如表1所示,与正常组相比,模型组、低剂量组、高剂量组miR-886-5p表达水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组miR-886-5p表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组miR-886-5p表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组ALT、AST水平比较 如表1所示,与正常组相比,模型组、低剂量组、高剂量组ALT、AST水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组ALT、AST水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组ALT、AST水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5各组TNF-α、IL-6水平比较 如表1所示,与正常组相比,模型组、低剂量组、高剂量组TNF-α、IL-6水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组TNF-α、IL-6水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组TNF-α、IL-6水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6各组肺组织TGF-β1/Smad3通路蛋白相对表达量 如表1、图3所示,与正常组相比,模型组、低剂量组、高剂量组TGF-β1、Smad3表达量升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组TGF-β1、Smad3表达量降低,具有统计学差异(P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组TGF-β1、Smad3表达量降低,具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组miR-886-5p、ALT、AST、TNF-α、IL-6表达水平及肺组织TGF-β1/Smad3通路蛋白相对表达量比较

图3 各组肺组织TGF-β1/Smad3通路蛋白表达

3 讨 论

肺结核是种慢性传染病,人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、尘肺患者、糖尿病患者、免疫力低下者容易感染该病。患者咳嗽、大笑、谈话、打喷嚏的时候可把含有结核分歧杆菌通过呼吸道进行传播,被其他健康人吸入从而引发感染〔9,10〕。该病可以通过胸部X线检查,可发现肺结核病变位置、范围、形态等,根据其判断有无空洞、病变性质等。夏枯草为多年生草本植物,其适应性较强,整个生长过程不易发生病虫害,有消肿、清肝、清火明目的功效。夏枯草主要的活性成分是夏枯草硫酸多糖,属于含有硫酸基的多糖,有抗炎、抗氧化的作用〔11,12〕。

miR-886-5p可较好地反映机体感染结核杆菌后机体发生的免疫答应,能作为肺结核严重程度的指标〔13〕。由于结核病和乙肝均是在患者免疫力低下的时候发生,临床上两种疾病合并发生较为常见,且长时间用抗结核药物会引发药物性肝损伤,保护好肝功能尤为重要〔14〕。ALT存在肝细胞质内,是由两条相同的多肽链亚单位组成,是肝脏功能的重要指标,其正常参考值为0～40 U/L〔15〕。AST主要分布在肝脏、心肌等组织中,是反映肝损伤的主要指标,一旦肝细胞受损,AST会大量释放入血〔16〕。TNF-α可激活不同的途径诱导凋亡,可以促进T细胞产生各种炎症〔17〕。IL-6是一种多效细胞因子,在机体发生炎症反应、感染时,多种细胞因子可诱导机体产生IL-6〔18〕。本研究结果显示,夏枯草硫酸多糖可以起到抑制大鼠肺组织miR-886-5p的水平,具有抗炎、抗氧化的作用。可以使ALT、AST、TNF-α、IL-6水平降低,提示其与肺结核紧密相关,可改善肝功能,减轻炎症反应。

TGF-β1/Smad3信号通路参与了多种炎症反应相关的疾病〔19〕。有研究表明,TGF-β1/Smad3信号通路导致肺纤维化,参与了复杂多样的生物过程,有促细胞、抗增生的作用〔20〕。TGF-β1分布广泛,通过信号传导完成TGF-β1生物学作用。Smad3是TGF-β1表达的下游信号通路,与众多的心肌、肺、肾等组织纤维化紧密相关〔21〕。本研究结果显示,夏枯草硫酸多糖有抗炎、抗氧化应激的作用,通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路蛋白可以减少肺结核大鼠的病变,发挥抗炎作用,减轻细胞浸润,表明TGF-β1/Smad3信号通路与肺结核的发生紧密相关。但目前未有研究将其用于肺结核的研究中,因此上述研究需后续研究进一步分析验证。

综上所述,肺结核发生后炎性因子、肝功能指标上升,经过夏枯草硫酸多糖干预后可使炎症及肺结核组织病变减轻、肝功能改善,经过夏枯草硫酸多糖下调miR-886-5p干预后可使肺结核临床症状改善,其机制可能与TGF-β1/Smad3通路被抑制有关。