巨噬细胞极化在缺氧性肺动脉高压中的作用

孙得胜 刘虹延 罗志梅 欧阳瑶 刘先胜

(1遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科,贵州 遵义 563003;2华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科 国家卫健委呼吸疾病重点实验室;3遵义医科大学附属医院针灸科)

肺动脉高压可作为独立的疾病,也可作为一些疾病的病理改变,如慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化及动脉粥样硬化性疾病,严重威胁患者生命,其特点是持续的小动脉收缩和重塑〔1～6〕。肺动脉高压分为5个临床亚组:动脉性肺动脉高压、左心疾病所致肺动脉高压、肺部疾病和(或)低氧所致肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压和其他肺动脉阻塞性疾病、未明和(或)多因素所致肺动脉高压。现在广泛认为低氧驱动的肺血管重构是引起肺动脉高压的潜在机制。慢性缺氧引起血管重构,继而引起肺动脉高压、右心室肥厚,最后引起右心衰竭。血管重构表现为血管壁增厚伴血管肌化和远端血管稀疏。在缺氧条件下,肺动脉往往会发生收缩,而这种收缩即在通气血流比值不匹配的情况下出现血液从肺部通气不良的区域转移到通气良好的区域,从而产生更好的氧合,因此更加重了肺功能的降低〔7～11〕。众多炎症细胞被证实与肺动脉高压相关,其中巨噬细胞的富集,特别是M2型巨噬细胞的富集在肺血管重构中起到了关键作用〔4,12〕。现今针对肺动脉高压的发病机制仍处于探究阶段,所以临床上针对肺动脉高压的治疗大多旨在改善肺血管重塑,长远疗效欠佳〔13〕。本研究在缺氧干预下构建肺动脉高压模型,并观察这一过程中巨噬细胞极化状态的改变及其与缺氧性肺动脉高压的关系,探究肺动脉高压的发病机制,为临床治疗肺动脉高压提供新的依据。

1 材料与方法

1.1实验材料 本研究于2018年1～5月在华中科技大学同济医学院实验动物中心进行。20只健康清洁级SD大鼠,体质量约200 g,购于湖北省实验动物中心〔SCXK(鄂)2015-0018〕实验动物缺氧装置(本课题组自主研发,专利号 ZL201820232330.7),Olympus 光学显微镜(奥林巴斯有限公司),通用型免疫组化试剂盒(上海基因科技公司),小鼠抗大鼠CD68、Arg1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2造模方法 采用随机数字表法将大鼠分为对照组和模型组,各10只,模型组在实验动物缺氧装置中给予常压缺氧(10%O2)处理,每天缺氧处理8 h,同时给予充足饮食,持续4 w。对照组不予以低氧刺激,在常氧条件下喂养。若模型组右心室收缩压高于对照组,且差异有统计学意义表示建模成功。

1.3血流动力学检测 在生理多导仪监视下,将大鼠颈静脉分离出来,结扎远心端,将内含导丝的测量管插入并缓慢推进,分别经过锁骨下静脉,右心房、右心室,当有血液回流时,退出导丝,连接探测仪,观察波形并调整导管方向,待波形典型并稳定后记录,最后以 PowerLab 软件分析右心室收缩压。

1.4巨噬细胞检测 免疫组织化学方法观察肺组织中巨噬细胞的标志物CD68和M2型巨噬细胞标志物Arg1、M1型巨噬细胞标志物iNOS表达水平及分布特点。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1血流动力学 模型组右心室收缩压〔(33.33±6.11)mmHg〕显著高于对照组〔(21.33±3.06)mmHg;t=3.043,P<0.05〕,参照国际共识,肺动脉高压模型建立成功。见图1。

2.2巨噬细胞表达 如图2所示,模型组肺组织中巨噬细胞标志物CD68表达强于对照组,表明缺氧性肺动脉高压肺组织中有大量巨噬细胞浸润。

2.3M1及M2型巨噬细胞表达 如图3所示,以免疫组织化学法对肺组织中M1及M2型巨噬细胞标志物iNOS及Arg1进行染色,发现模型组肺组织中Arg1表达水平强于对照组,iNOS表达水平弱于对照组。

图1 两组右心室收缩压波形

图2 两组巨噬细胞标志物CD68表达(免疫组化染色,×400)

图3 两组iNOS及Arg1表达(免疫组化染色,×400)

3 讨 论

本研究结果证实,肺动脉高压模型中巨噬细胞明显富集,并且巨噬细胞朝着M2型的方向极化在缺氧肺动脉高压中发挥着重要作用。因为对血管重构发生机制了解尚不完全,所以临床上针对肺动脉高压的治疗,主要是以改善症状的药物如肺血管扩张剂及针对肺动脉高压形成通路的靶向药物为主,前者包括钙通道阻滞剂、前列腺素、内皮素受体阻滞剂及磷酸二酯酶-5抑制剂,后者主要针对前列环素通道和内皮素受体途径治疗〔14〕。除了药物治疗之外,慢性血栓栓塞性肺动脉高压还可以用外科手段,如肺动脉内膜切除术及球囊肺血管成形术治疗〔15〕。上述药物或手术处理可以缓解肺动脉高压的临床症状,且在一定程度上提高肺动脉高压患者的生存率。并且在发现了免疫细胞及炎症细胞对肺动脉高压发病中起重要作用后,针对免疫细胞、炎症细胞及肺部平滑肌细胞之间的相关关系有了进一步研究,很多针对这些细胞的药物被运用到临床上,并且取得了极好的疗效。但是肺动脉高压的发病机制未能够有一个全面的了解,仍然无法逆转较大范围的肺小动脉重构,所以临床疗效有待提高,现在仍需对肺动脉高压的发病机制,特别是针对肺动脉高压发病中免疫细胞及炎症细胞的作用做进一步探索研究。

在肺动脉高压的发病过程中,炎症和肺内皮功能障碍都与肺动脉高压的发生和发展相互交织。包括白细胞聚集和抑制在内,免疫过程是炎症反应和相关疾病的中心步骤,在组织病理学上,肺动脉高压患者和实验肺动脉高压动物模型的肺血管病变组织的特征是不同程度的血管周围炎性细胞浸润,包括T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞,很多研究者针对巨噬细胞对于肺动脉高压血管重构的作用进行研究〔16〕。有研究发现,单核细胞和巨噬细胞在血管周围或外膜空间的积聚是人类和实验肺动脉高压动物模型中发生血管重构的主要特征标志之一〔17〕。Pullamsetti等〔18〕在人肺癌组织及小鼠肺癌模型组织中均发现有肺动脉高压的典型病理特征,即肺小动脉血管重构;肿瘤细胞和炎症细胞相互作用及多种细胞因子,如白细胞介素(IL)-8、趋化因子配体2等共同促进了肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移;并且免疫及炎症细胞的缺陷会阻止肺动脉高压的形成。而巨噬细胞的两大不同极化类型,即M1及M2型,分别有着不同的作用。M1型在活化后能产生多种促炎症细胞因子,抵抗病原入侵。M2型分泌抗炎症细胞因子,并在组织修复与重建、血管重塑、脂类代谢、过敏反应和肿瘤的形成过程中发挥作用。Zawia等〔19〕通过检测缺氧肺动脉高压模型中F4/80+巨噬细胞(巨噬细胞总体数量)、iNOS+巨噬细胞(M1型巨噬细胞)、CD206+巨噬细胞(M2型巨噬细胞)发现在缺氧诱导的肺动脉高压模型中,巨噬细胞总体数量显著增加,M1与M2型巨噬细胞稳态被打破,呈现为M2型巨噬细胞比例显著升高。Vergadi等〔20〕检测了缺氧诱导型肺动脉支气管肺泡灌洗液中的M2型巨噬细胞标记物Arg1,Fizz1,Ym1及M1型巨噬细胞标记物iNOS、肿瘤坏死因子(TNF)-α、 IL-12β同样呈现出缺氧条件下巨噬细胞增多且向M2型极化,除此之外,在体外缺氧条件下巨噬细胞原代培养也表现向M2型极化的趋势。Park等〔7〕利用巨噬细胞甘露糖受体的示踪剂68Ga-NOTA-MSAPET成像显示肺动脉高压患者及动物模型中巨噬细胞,发现随着肺动脉高压的进展,巨噬细胞在肺中浸润的程度也不断上升。同样,为了证实巨噬细胞参与肺动脉高压的形成及消除巨噬细胞有利于改善肺动脉高压模型中的血管重构,在研究中往往需要使用特定的方法清除巨噬细胞。除了使用含氯膦酸脂质体来耗尽单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞这一方法外,Zawia等〔19〕利用CD68+MacLow小鼠巨噬细胞耗竭的低巨噬细胞转基因小鼠,利用多西环素处理后证实,巨噬细胞减少有利于改善肺动脉高压中的血管重构。在特发性肺动脉高压的研究中发现,肺动脉高压患者肺中M2巨噬细胞标记物占优势,而健康个体肺中M1巨噬细胞亚型占优势,巨噬细胞活化为M2表型主要触发巨噬细胞和肺动脉平滑肌细胞,因此可能是肺血管重塑过程中的早期关键事件〔21〕。在肺动脉高压发生的病理过程中,肺小血管重构是不可或缺的一步。本研究证实在缺氧所致肺动脉高压中,巨噬细胞向着M2型的极化且有统计学意义,这也许是因为在机体内参与血管重构的M2型巨噬细胞推动了缺氧肺动脉高压的发生进程。

综上,缺氧性肺动脉高压的发生发展中,巨噬细胞的募集和朝着M2这一亚型的极化可能在这一过程中发挥了作用。肺动脉高压的发生机制尚未完全阐明,但M2巨噬细胞在其中发挥的关键作用可能作为临床上治疗缺氧性肺动脉高压的依据,抑制巨噬细胞的募集或抑制巨噬细胞向M2亚型的极化可能作为临床上针对肺动脉高压的新的治疗方法。本研究将探讨巨噬细胞影响缺氧性肺动脉高压的上游因子,继续探索肺动脉高压的发生机制,为临床治疗提供依据。