基于代谢组学分析溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织代谢特征及疾病机制

王佳林 马秀兰 韩金荣 朱西杰

(宁夏医科大学 1护理学院,宁夏 银川 750004;2中医药现代化教育部重点实验室;3中医学院)

溃疡性结肠炎(UC)是一种持续或反复发作的肠道慢性炎症性疾病〔1〕,病变主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下,腹痛、腹泻和黏液脓血便或血便、里急后重是其最主要症状,还伴有食欲不振、贫血、发热、乏力、体质量下降等全身症状及皮肤口腔黏膜、眼、关节及肝胆等肠外表现〔2〕。炎症性肠病的动态发展常伴随着机体代谢紊乱,影响能量代谢与氨基酸代谢途径,导致内源性代谢物水平发生系统性改变而加剧肠道炎症的发展〔3,4〕。近年来,应用代谢组学技术研究疾病成为热点。UC 作为人类生活中的常见病,代谢组学有望成为UC早期诊断的重要方法,并能为解释 UC 的疾病机制提供新的技术手段〔5〕。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术,以疾病代谢产物为切入点,研究UC大鼠模型在疾病发生过程中,机体内源性代谢物变化。以期为推进对 UC 的早期诊断,明确UC疾病病因提供新指标及为临床治疗UC寻找作用靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料 柳氮磺吡啶(Y23A9C59570,源叶生物);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS;SLCG2384,美国Sigma公司);粪便隐血试剂盒(0730A20,信帆生物技术有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,Merck);甲酸(色谱纯,Aladdin)。

1.2实验动物 SPF级SD大鼠20只,雄性,体质量180～210 g。大鼠及其生长维持饲料均由宁夏医科大学实验动物中心提供,饲养于宁夏医科大学实验动物中心屏障。温度、湿度适宜,分笼饲养。许可证号SCXK(宁)2020-0001,实验动物伦理审批号:IACUC-NYLAC-2020-022。

1.3实验仪器 超高效液相色谱(UPLC;ExionLC AD,https://sciex.com.cn/),四级杆飞行时间质谱(TripleTOF 6600,AB SCIEX)。

1.4模型制备及样本采集 根据随机分组实验方法,将大鼠分为空白组6只和模型组14只。根据参考文献及课题组前期造模经验〔6,7〕,模型组禁食不禁水36 h,10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉,TNBS-50%乙醇溶液灌肠〔5%TNBS(0.45 ml/100 g)+50%乙醇,两者2∶1体积混合〕。造模3 d后,观察一般情况、体质量变化、饮食饮水状况。利用粪便隐血定性检测试剂盒检测粪便隐血情况;随机选取5只造模大鼠,麻醉杀检,结肠组织病理学观察,验证UC模型制备情况。造模成功后,取病变结肠组织,进行UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学检测。

1.5UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学检测 ①广泛靶向检测采集条件:T3方法色谱采集条件:色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流动相:A 相为超纯水(0.1 % 甲酸),B 相为乙腈(0.1 %甲酸);流速 0.35 ml/min;柱温40 ℃;进样量2 μl。②T3方法质谱采集条件:电喷雾离子源(ESI)温度 500 ℃,质谱电压5 500 V,-4 500 V,离子源气体(GS)Ⅰ 50 psi,GS Ⅱ 50 psi,气帘气(CUR) 25 psi,碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高。根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测。

1.6统计学处理 数据采集仪器系统主要包括UPLC和串联质谱(MS/MS;QTRAP®,https://sciex.com/)。利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据。运用R软件〔R(MetaboAnalystR)〕进行主成分分析(PCA),对数据进行UV标准化,排除非相关因素使分组最大化;采用OPLS-DA模型第一主成分变量权重(VIP)值>1的代谢物,并结合学生t检验的P值(<0.05)通过去除不相关的差异来筛选差异变量,寻找差异性表达代谢物。

2 结 果

2.1PCA 在做差异分析前,首先对进行差异比较的分组样品进行PCA,观察差异分组之间和组内样本之间的变异度大小。如图1A所示,两组95%可信区间有交集,但样本呈现分离趋势;同时在图1B中可以显示两组间明显的空间差异,PCA结果说明模型组与空白组存在代谢差异。

2.2正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 根据OPLS-DA模型分析代谢组数据,绘制各分组得分图,展示各个分组间的差异。通过去除不相关的差异,空白组、模型组样品呈现完全分离,筛选出2个差异主成分变量(图2A)。评价模型的预测参数Ry2=0.957,Q2=0.541,表明该模型拟合度和预测能力都较理想(图2B)。OPLS-DA的S-plot图中红色的点表明这些代谢物的VIP值≥1,绿色的点表示这些代谢物的VIP值<1,结果表明模型组和空白组的主成分与代谢物存在明显差异(图2C)。

2.3差异代谢物筛选结果 UC大鼠模型结肠组织中差异性代谢物的筛选结果如表1、2所示,通过 OPLS-DA 分析,根据VIP>1、概率P<0.05 的标准,经 HMDB 数据库检索筛选,共鉴定出47种差异性代谢物。对筛选物质进行物质一级分类,上调的31种物质分别归属于醇/胺类(7种)、有机酸及其衍生物(6种)、氨基酸及其代谢物、激素及激素相关物质各4种、甘油磷脂类、辅酶和维生素、其代谢物各两种,杂环化合物、脂肪酰类、核苷酸及其代谢物、碳水化合物各1种;下调的16种物质分别归属于有机酸及其衍生物(6种)、甘油磷脂类(4种)、脂肪酰类(2种)、碳水化合物及其代谢物、激素及激素相关物质、鞘脂类、氨基酸及其代谢物各1种。

图1 PCA

图2 OPLS-DA

表1 差异代谢物数目统计(上调)

2.4差异代谢物VIP值图 运用VIP+FC+p-value/FDR三重筛选条件下筛选出模型组与空白组的差异代谢物共129种,这些物质中上调的88种,下调41种(图3A)。同时,精确在OPLS-DA模型中VIP值最大的前20个代谢物进行注释及挖掘生物信息。发现上调物质有18种,分别为苯乙酰甘氨酸、N-(邻甲苯酰)甘氨酸、对甲苯基硫酸、LPE(18∶1/0∶0)、2-〔(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-戊烯氧基〕丁酸、LPC(18∶2/0∶0)、孕烯醇、LPC(0∶0/18∶1)、LPE(0∶0/18∶2)、Thr-Glu-Leu-Lys、LPC(16∶1/0∶0)、1-(13Z,16Z-docosadienoyl)-glycero-3-phosphate、Hecogenin、LPE(0∶0/16∶1)、LPE(18∶2/0∶0)、LPE(14∶0/0∶0)、10-脱氧甲霉素、Glycerophospho-N-Palmitoyl Ethanolamine;下调物质2种,分别为〔(2S)-2-hexadecanoyloxy-3-tetradecanoyloxypropyl〕(6Z,9Z,12Z,15Z)-octadeca-6,9,12,15-tetraenoate、LPC(O-16∶1/0∶0)。见图3B。

表2 差异代谢物数目统计(下调)

图3 差异代谢物

3 讨 论

氨基酸作为生物体中一类重要的活性分子,是蛋白质分子的基本单位,能够直接参与生物体的新陈代谢,包括炎症性肠病(IBD)在内的许多疾病的发生都与氨基酸代谢异常密切相关〔4,8～11〕。由于肠道炎症会造成氨基酸代谢途径紊乱,因此氨基酸类代谢物被认为是与结肠炎相关的重要生物标志物〔11〕。本研究中,模型组结肠组织中苯乙酰甘氨酸(氨基酸及其代谢物)、N-(邻甲苯酰)甘氨酸(氨基酸及其代谢物)出现上调。苯丙氨酸上升可能是与大鼠体内一种能转换苯丙氨酸生成酪氨酸的酶,即苯丙氨酸-4-羟化酶受到损伤且含量下降有关〔12,13〕,并且已有炎症性肠病患者代谢组学筛选研究中显示尿液中升高的甘氨酸和尿液中显著降低水平的乙酰乙酸能够区分活动性和缓解期炎症性肠病〔14,15〕。本研究结果说明,模型组中氨基酸代谢通路受到扰动,可能与苯丙氨酸代谢途径发生改变相关联。

研究表明,甘油磷脂水平的变化能反映脂质代谢紊乱,是一个重要的生物学指标,甘油磷脂可以分为不同的类别,包括甘油磷酸甘油、甘油磷脂酸、甘油磷酸肌醇、甘油磷酸丝氨酸、甘油磷酸乙醇胺和心磷脂〔16〕。其基本结构是磷脂酸和磷酸相连的取代基团,根据取代基团的不同可分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油等,此类成分在失去1条脂肪酸侧链可转变为相应的溶血性磷脂,这些磷脂是磷脂酶A2产生游离花生四烯酸和各自溶血磷脂的底物,具有加重炎症反应的作用〔17〕。三酰甘油作为循环中丰度最高的脂质,与炎症关系密切,脂质代谢异常与多种疾病的发生有着密切的联系,如高脂血症、阿尔茨海默病及癌症等〔18～20〕。研究显示,UC 小鼠出现脂质代谢紊乱及相关炎性因子的变化〔21〕。赵丽丽〔22〕研究发现,甘油磷脂PC(16∶0/18∶1)和PE(18∶0/18∶1)的代谢调节贯穿于炎症的发生和消退过程,可能是炎症发生、消退过程中的重要脂质标记物。而本研究结果表明,脂质代谢异常也与UC发生具有显著相关性。另外,在本研究中其他3种物质甲苯基硫酸(有机酸及其衍生物),孕烯醇(醇、胺类),10-脱氧甲霉素(未知)是首次发现的物质,目前尚无相关报道。推测可能是大鼠经TNBS-乙醇复合造模法造模后,内源性代谢物水平发生变化产生代谢的异常物质。

综上,UC发生展过程中,与体内氨基酸代谢如苯乙酰甘氨酸、N-(邻甲苯酰)甘氨酸、脂质代谢物质如甘油磷脂类物质、三酰甘油等物质代谢异常有关,疾病代谢机制可能与相关代谢产物激活氨基酸代谢通路及脂质代谢通路相关联,具体相关联的通路及激活机制还需本课题组深入研究。