那可丁对肺癌细胞血管生成、Yes相关蛋白及敏感性的作用机制

汤顾航 杜先凤 姜力豪

(重庆市大足区人民医院,重庆 402360)

肺癌是恶性肿瘤患者死亡率升高的主要原因之一,非小细胞肺癌(NSCLS)占肺癌发病率的80%～85%,但随着医疗诊断及治疗技术的发展,NSCLS患者5年预后有所改善,但是对于诊断时已经处于中晚期NSCLS患者而言预后仍然不佳〔1〕。手术是肺癌患者临床治疗主要方法,但术后复发率高达50%以上。化疗能够显著改善晚期NSCLS患者临床疗效,但是NSCLS细胞对顺铂类药物耐药增加限制了临床引用,因此寻找NSCLS治疗新药已经刻不容缓。肺癌血管新生可促进癌细胞侵袭转移,可将癌细胞送至靶器官恶化病情,因此对肺癌细胞新生血管的抑制可能成为减低癌细胞转移的重要途径〔2〕。相关研究表示,恶性肿瘤的发生发展与致癌因子激活抑癌因子失活相关,Hippo信号通路初次是在黑腹果蝇体内被发现的具有调节细胞生长及凋亡等作用〔3〕。YES相关蛋白YAP是Hippo信号通路的重要因子之一,正常环境下主要表达在细胞质具有维持器官大小及内环境稳定的作用,但在Hippo信号失活后YAP激活在组织过度激活,被认为是一种致癌基因。齐良波等〔4〕研究表示,在肺癌组织中YAP蛋白表达上调与患者疾病进展及预后不佳密切相关。近些年,将天然化合物应用于抗肿瘤临床研究已经成为研究热点。那可丁是从罂粟属植物鸦片中提取的一种生物碱,主要作为镇咳药物被广泛应用,但是随着对于研究深入并通过体外及体内实验均证实具有抗恶性肿瘤的作用〔5〕。那可丁具有抗肺癌细胞活性的作用,认为可以作为治疗肺癌的潜在药物。但是关于那可丁是否具有抑制肺癌细胞血管生成及YAP水平还暂无研究,所以,本文以此作为创新点观察那可丁抗肺癌效果,为临床治疗用药提供选择依据。

1 材料与方法

1.1实验细胞 非小细胞肺癌 A549 细胞购于中科院上海细胞库。A549 细胞放入37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养,24 h后弃去培养体后加入含有1%双抗的10%的胎牛血清中培养,培养条件同上。显微镜下观察SGC-7901细胞生长至80%～90%时进行传代,75%乙醇消毒,弃去旧的培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,加入0.25%胰蛋白酶消化,生长至90%时终止反应,脱壁后,放入15 ml的离心管中1 000 r/min,5 min后,弃去上清液放入培养基中2～3 d传代。

1.2主要试剂及仪器 胎牛血清、RPMI1640培养基购自杭州四季青生物工程材料;二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma;YAP、磷酸化(p)-YAP多克隆抗体购自Santa cruz biotechnoiogy公司;鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、兔抗人血管内皮细胞生长因子(VEGF)单克隆抗体、兔抗人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)2单克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-9单克隆抗体均购自中国上海圻明生物科技;山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及山羊抗小鼠IgG购自中国武汉纯度生物科技;Transwell 小室(3413)购自美国康宁公司;酶标仪(Elx800)购自美国Bio-Tek 公司;TDZ4-WS 低速台式离心机购自中国湖南湘瑞生物;凝胶成像系统及Western印迹电泳系统均购自中国背景赛百奥科技。

1.3药物来源及配制 那可丁由东北制药集团公司沈阳第一制药厂生产,批号:H20054494;顺铂购自江苏豪森集团有限公司,批号:H20040813。药物配制:3 ml的DMSO与那可丁粉末充分混匀,调制成浓度为80 mmol/L的原液,以0.5 ml分为装入1 ml试剂管中,低温保存备用。顺铂浓度为5 mg/ml避光保存。

1.4分组及处干预 A549 细胞重悬细胞后,按照1.5×106/ml接种于96孔版中,分为肺癌组(无干预的A549 细胞)、低浓度那可丁组(A549 细胞与20 μmol/L那可丁共培养)、中浓度那可丁组(A549细胞与40 μmol/L那可丁共培养)、高浓度那可丁组(A549细胞与80 μmol/L那可丁共培养),顺铂(DDP)组(A549细胞与20 μmg/L DDP共培养),各组细胞培养24 h后显微镜观察形态改变。

1.5Transwell 法检测A549 细胞侵袭能力 采用基质胶无血清培养稀释铺于Transwell小室上室,2 h后,取各组培养24 h后的A549细胞数目为1×106/ml加入含有基质胶的Transwell小室上室,下室加入完全培养基,孵育24 h后,保留Transwell小室液体,4%多聚甲醛固定30 min,1%的结晶紫染色10～20 min,树胶封片,显微镜下观察穿过底膜的细胞数即为侵袭细胞数。

1.6划痕检测各组A549细胞迁移能力比较 对数生长的A549细胞成悬浮液体,均种入24孔细胞培养板种,单层生长后弃去培养液,用200 μl枪头在24孔板中划一条痕,干预24 h后观察细胞划痕愈合,实验重复3次,利用Image Pro Plus软件,取均值,数据用统计软件分析。

1.7体外血管形成实验 在A549 细胞96孔板中添加200 μl的基质胶,细胞培养箱中凝固60 min,后收集各组细胞制成单细胞悬液,密度调整为5×105个/ml,每孔添加500 μl单细胞悬液,均匀分布细胞基质胶上孵育48 h,进行拍照后观察封闭管腔形成数量,实验重复3次取平均值。

1.8CCK-8检测A549 细胞对DDP的耐药作用 取对数生长的A549细胞,细胞浓度的2×105/ml,接种96孔板中培养24 h后,分别加入0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L的DDP于细胞培养板中,后每孔80 μmol/L的那可丁,后继续培养48 h,每孔细胞中加入10 μl的CCK-8溶液,孵育2 h,结束后取出培养板于450 nm吸光度。

1.9免疫印迹检测A549细胞bFGF2、VEGF、MMP-9及YAP蛋白水平 A549 细胞移入孔6板中,细胞浓度为2.5×104个ml,PBS冲洗,加入150 μl RIPA的裂解液,12 000 r/min离心15 min后,放入样孔中,进行电泳实验。聚偏氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min,反复PBS冲洗,5 min/次,加入bFGF2(1∶500 )、VEGF(1∶500 )、MMP-9(1∶1 000)、YAP(1∶500)及p-YAP(1∶500)和内参GAPDH抗体(1∶1 000),TBS冲洗3次后,加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔(1∶5 000),杂交冲洗。后将膜浸入电化学发光(ECL)工作液,随后进行检测,获取图像。

1.10统计学分析 采用GraphPad Prism8软件进行方差分析,事后检验采用Bonferroni法进行组间两两比较。

2 结 果

2.1那可丁对A549细胞形态的影响 肺癌组肺癌细胞呈现上皮样贴壁生长,细胞形态为长梭形,细胞核大,经不同浓度那可丁处理或DDP处理后,细胞数目减少,细胞亮点增加,说明存在细胞死亡。见图1。

2.2那可丁对A549细胞侵袭数目及划痕愈合率比较 与肺癌组相比,低、中、高浓度那可丁组及DDP组侵袭数目及划痕愈合率均显著降低(P<0.05);与低浓度那可丁组相比,中、高浓度那可丁组及DDP组侵袭数目及划痕愈合率显著降低(P<0.05);与中浓度那可丁组及DDP组相比,高浓度那可丁组侵袭数目及划痕愈合率显著降低(P<0.05);高浓度那可丁组与DDP组上述指标相比无统计学意义(P>0.05),见表1、图2及图3。

图1 各组A549细胞形态(吉姆萨染色法,×200)

表1 各组A549细胞侵袭数目及划痕愈合率比较

2.3那可丁对各组A549细胞体外血管形成能力比较 与肺癌组相比,低、中、高浓度那可丁组及DDP组体外血管形成能力降低(P<0.05),与低浓度那可丁组相比,中、高浓度那可丁组体外血管形成能力降低(P<0.05),与中浓度那可丁组相比,高浓度那可丁组体外血管形成能力降低(P<0.05),高浓度那可丁组与DDP组上述指标相比无意义(P>0.05),见表2及图4。

图2 各组A549细胞侵袭(结晶紫染色,×200)

图3 各组A549细胞划痕愈合(结晶紫染色,×200)

2.4DDP联合那可丁对A549 细胞抑制率的影响 DDP组及DDP+那可丁组在DDP浓度为0 mg/L时比较无统计学意义(P>0.05),在DDP浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L时DDP+那可丁组的肺癌A549细胞抑制率均显著高于DDP组(P<0.05),见表3。

2.5那可丁对各组A549细胞YAP及p-YAP蛋白水平比较 与肺癌组相比,低、中、高浓度那可丁组及DDP组细胞中YAP及p-YAP水平显著降低(P<0.05),低、中及高浓度那可丁组YAP及p-YAP水平逐渐降低,相互比较存在显著差异(P<0.05),高浓度那可丁组与DDP组YAP及p-YAP水平比较无统计学意义(P>0.05),见表2、图5。

2.6那可丁对各组A549细胞VEGF、bFGF2及MMP-9蛋白水平的影响 与肺癌组相比,低、中、高浓度那可丁组及DDP组细胞中VEGF、bFGF2及MMP-9水平显著降低(P<0.05),低、中及高浓度那可丁组VEGF、bFGF2及MMP-9水平逐渐降低,相互比较存在统计学差异(P<0.05),高浓度那可丁组与DDP组VEGF、bFGF2及MMP-9水平无统计学意义(P>0.05),见表2、图5。

表2 各组A549细胞环状血管数量、VEGF、bFGF2及MMP-9、YAP、p-YAP蛋白水平比较

图4 各组A549细胞体外血管形成能力比较(吉姆萨染色法,×200)

表3 DDP联合那可丁对A549 细胞抑制率的影响

1～5:肺癌组、低浓度那可丁组、中浓度那可丁组、高浓度那可丁组、DDP组图5 各组A549细胞VEGF、bFGF2、MMP-9、YAP及p-YAP蛋白水平比较

3 讨 论

DDP自FDA批准应用于殖系统恶性肿瘤临床治疗取得较好的治疗效果后已经被广泛应用于抗癌,例如乳腺癌、肺癌等均取得了较好的效果。但是由于铂类药物结构相似在抗癌过程中有严重的耐药性,这限制了药物的应用及开发,因此对新型抗肿瘤、增加DDP敏感性药物的研发已经成为重中之重,对于临床治疗具有深远意义。

本文研究发现,A549细胞经不同浓度那可丁处理后其侵袭及迁移能力均降低,以高浓度那可丁组效果最佳,与DDP疗效相似。良性肿瘤及恶性肿瘤的区别重点在于能否发生转移,肺癌细胞侵袭及迁移产生是一个多因素、多信号通路及多环节相互作用的动态调控过程,癌细胞侵袭及迁移可影响患者预后,因此有效抑制侵袭及迁移对于改善肺癌患者生存率具有重要意义〔6〕。那可丁的主要活性成分为邻苯二甲酸异喹啉生物碱,最早应用于临床镇咳,近些年部分学者通过体外实验证实那可丁可发挥抗肿瘤作用,例如胰腺癌、宫颈癌、结肠癌等〔7,8〕。祝美玲等〔9〕研究证实,那可丁可与微管蛋白结合后通过延长微管静止期抑制形成进而减少癌细胞有丝分裂而发挥抗癌作用。而部分学者发现紫杉醇也属于微管抑制剂与那可丁均可以通过调节半胱天冬氨酸酶(caspase)和p21等信号通路而抑制癌细胞活性。那可丁具有加快肺癌细胞凋亡,抑制增殖的作用,本文认为不同浓度的那可丁可通过抑制细胞血管生成而加快凋亡,减少侵袭及迁移,且呈现浓度依赖性。

本文研究发现,那可丁可以通过抑制VEGF、bFGF2及MMP-9活性而减少肺癌细胞体外管腔形成,从而减少细胞恶性侵袭及迁移。肺癌细胞的侵袭及迁移离不开新生血管生成,当瘤体直径超过3 mm是可激活血管内皮细胞生长因子VEGF水平而促进肿瘤内新生血管形成,进一步加快肿瘤浸润、转移〔10,11〕。肺癌组织中MMP-9表达升高,可破坏组织结构及基底屏障而有利于肿瘤形成及转移。血管生长是血管刺激因子与抑制因子失调的结果,bFGF在肺癌中被激活可激活血管生长因子VEGF表达而加快瘤体生长,恶化病情〔12〕。在以往的文献研究中,结肠癌SW480细胞中VEGF及MMP9表达升高采用那可丁干预后表达降低,认为那可丁可以通过抑制肝肠-钙黏连蛋白(LI-cadherin,CDH17)表达而降低癌细胞血管生成和侵袭迁移〔13〕。那可丁被作为缺氧诱导因子(HIF)-1的抑制剂,在胰腺癌细胞中那可丁可以可显著抑制HIF-1的靶基因——VEGF的表达而发挥抗肿瘤血管生成的作用〔14〕。因此,本文推测那可丁在肺癌细胞中具有VEGF、bFGF2及MMP-9活性而降低环状血管形成的作用。

DDP是临床肺癌治疗的首选药物,主要作用于DNA可以通过抑制癌细胞中DNA复制而加快癌细胞凋亡。但是随着临床肺癌患者易对其形成耐药性而限制了其应用〔15〕。本文研究发现,DDP联合那可丁可减少肺癌细胞耐药性,降低活性。近些年,将DDP与一些药物联合应用于抗恶性肿瘤的治疗已经取得了一定进展,例如在抗肺癌细胞中采用DDP联合异黄腐酚可以逆转肺癌细胞DDP耐药,在肝癌细胞体外实验中将DDP与复方母鸡颗粒共培养后可显著抑制癌细胞增殖,加快凋亡,比单一DDP抗肿瘤效果更佳。DDP联合那可丁能够增加DDP耐药A549细胞敏感性,那可丁属于微管类化合物可以减少A549细胞对DDP耐药性,逆转耐药〔16〕。李岩等〔17〕研究发现,那可丁具有强大抑瘤效果,可以通过抑制增加细胞毒性作用而加快肺癌细胞凋亡,并减少耐药。YAP可作为致癌因子,在多种恶性肿瘤中高表达,例如胃癌、乳腺癌及肺癌中,已有研究证实66.3%的肺癌患者存在YAP过表达,并可显著促进细胞侵袭及迁移〔18,19〕。本文研究发现,那可丁可抑制肺癌细胞中YAP及其磷酸化,呈现浓度依赖性,认为那可丁可通过抑制YAP及pYAP表达而减少YAP下游因子转录作用而抑制癌细胞DNA复制,从而抑制癌症进展。那可丁与紫杉醇均属于微管抑制剂,抗肿瘤作用具有相似性。杨宇宸〔20〕研究表示,不同浓度紫杉醇均可以增加胃癌细胞凋亡,研究机制与抑制YAP蛋白及mRNA表达相关,因此,本文推测那可丁可降低YAP表达而发挥抗肺癌细胞血管生成的作用,但是研究机制还不清楚,需要进一步研究证实。

本文存在一定不足,未进行大鼠实验及样本量较少,关于那可丁对YAP的研究机制研究较少,今后应增加单位合作及样本量,为肺癌干预机制提供方向。