二烯丙基二硫增强DJ-1过表达人胃癌SGC7901细胞对5-FU的敏感性

寻 艺,夏 红,李志敏,刘 芳,苏 琦,苏 波,3

(1. 南华大学衡阳医学院肿瘤研究所,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室;2. 湖南省胃癌防治研究中心,南华大学附属第一医院肿瘤科;3. 南华大学衡阳医学院药学院药物药理研究所,湖南 衡阳 421001)

在我国常见肿瘤中胃癌发病率居第二位、死亡率居第三位[1]。多药耐药是造成传统化疗药物对胃癌疗效不佳、预后差的主要原因之一[2]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中主要的有机硫化合物,它通过多靶点干预影响多条信号通路、针对各种肿瘤发挥抗癌活性[3]。本实验室最近的研究证实,DADS通过上调RORα(retinoic acid-related orphan nuclear receptor α,维甲酸相关孤核受体α)负调控Wnt1(wingless-type MMTV integration site family member 1,无翅型MMTV 整合位点家族成员1)/β-catenin(β-连环蛋白)通路、抑制胃癌细胞生长、上皮-间质转化、迁移侵袭[4]。

DJ-1(protein/nucleic acid deglycase,蛋白/核酸去糖化酶),也称为帕金森病相关蛋白7,最初发现它与帕金森病等中枢神经系统疾病发生有关,此后许多研究显示,DJ-1扮演着癌基因的角色,与肿瘤发生发展、转移、耐药、复发等密切相关[5-6]。本实验室证实,过表达DJ-1可通过PTEN/AKT通路促进胃癌细胞体内外增殖、上皮-间质转化、迁移侵袭[7]。

过表达DJ-1可赋予胃癌SGC7901细胞多药耐药的表型,敲低DJ-1能增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性[8]。本实验室经蛋白质组学研究发现,DADS诱导白血病细胞分化与其下调DJ-1表达有关,表明DJ-1是DADS发挥抗肿瘤作用的潜在靶点[9]。DADS是否能拮抗DJ-1介导的胃癌细胞耐药尚不清楚。为此,我们观察DADS对VCR(Vincristine,长春新碱)耐药细胞和DJ-1过表达细胞增殖和凋亡的作用,分析DADS对耐药相关基因表达的影响,研究DADS是否能改善DJ-1过表达细胞对5-FU的敏感性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂胎牛血清(F8245)为杭州四季青生物工程公司产品;嘌呤霉素(P8230-25)购自北京索莱宝公司;DADS(317691)为Sigma公司产品;Total RNA Kit(LS1030)、荧光定量PCR试剂盒(A6001)购自Promega公司;逆转录试剂盒(K1622)购自Thermo公司;BCA蛋白定量试剂盒(CW0014)购自北京康为世纪生物公司;MTT购自上海碧云天生物技术公司;DJ-1抗体(ab18257)、Bcl-2抗体(ab692)、P-gp(P-glycoprotein,P-糖蛋白)抗体(ab261736)、XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein,X连锁凋亡抑制蛋白)抗体(ab227196)、caspase-3 抗体(ab13847)、FITC偶联的二抗购自Abcam公司;β-actin抗体(TA-09)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL发光试剂盒购自Millipore公司。

1.2 细胞培养人胃癌SGC7901细胞、VCR耐药SGC7901细胞由南华大学肿瘤研究所保存;实验室之前已建立DJ-1过表达细胞系[7],上述细胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,置于37 ℃培养箱。实验分为Control组、DADS组、VCR组、VCR+DADS组、DJ-1组、DJ-1+DADS组。

1.3 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测细胞增殖细胞接种于96孔板,每组设5个重复孔,用1.25、2.5、5、10、20 mg·L-15-FU (5-fluorouracil,5-氟尿嘧啶)细胞处理48 h;DADS浓度为30 mg·L-1;每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·L-1),孵育4 h,测定OD450值。以未处理组A值为参照,计算细胞增殖率,细胞增殖抑制率/%=1-(实验组A值/未处理组A值)×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡将3×105细胞接种6孔板,处理48 h后,用PBS洗涤收集的细胞,重悬于500 μL结合缓冲液,加入Annexin V-APC 和7-AAD,避光孵育15 min后上流式细胞仪检测。

1.5 qRT-PCR分别按照Total RNA Kit、逆转录试剂盒说明书进行总RNA提取和逆转录,SYBR荧光检测试剂盒用于Real-time PCR分析。MDR-1 (multidrug resistance 1): F: 5′-GACATGACCAGGTATGCCTA-3′, R: 5′-CTTGGAGACATCATCTGTAAGTC-3′; Bcl-2: F: 5′-AGATGTCCAGCCAGCTGCAC-3′, R: 5′-TGTTGCTTCACTTGTGGCC-3′; XIAP: F: 5′-GTGGTGGAAAACTGAAAAATTGG-3′; R: 5′-GAAAGTGTCGCCTGTGTTCTGA-3′; caspase-3: F: 5′-CTCGGTCTGGTACAGATGTCGATG-3′; R: 5′-CGTTAACCCCGGGTAAGAATGTGCA-3′; β-actin: F: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′, R: 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。相对定量分析采用ΔΔCT方法。

1.6 Western blotRIPA(radioimmunoprecipitation assay)细胞裂解液用于总蛋白提取,BCA法测定浓度后,各组等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜后封闭1 h,4 ℃孵育一抗过夜,洗膜后加二抗孵育1 h,洗膜后加ECL发光液,X片曝光。检测灰度值,β-actin作为内参,计算蛋白相对表达量。

1.7 免疫荧光4%多聚甲醛固定各组细胞,0.5%Triton X-100透化细胞,山羊血清封闭30 min后,37 ℃孵育一抗1 h, 之后用FITC偶联的二抗孵育1 h,室温下DAPI孵育5 min,荧光显微镜下拍照。

2 结果

2.1 DADS下调DJ-1过表达细胞DJ-1表达Western blot检测显示,与空载体组比较,DJ-1组表达明显增高(P<0.05)(Fig 1)。之前我们证实,30 mg·L-1DADS能抑制SGC7901细胞增殖[4],因此本实验仍采用30 mg·L-1DADS处理细胞。与DJ-1组比较,DJ-1+DADS组DJ-1蛋白水平降低(P<0.05)(Fig 1),表明DADS能下调过表达细胞DJ-1表达。

Fig 1 DJ-1 was down-regulated by DADS in DJ-1 overexpressed cells n=3)

2.2 DADS增强5-Fu诱导的DJ-1过表达细胞、VCR耐药细胞增殖抑制用1.25、2.5、5、10、20 mg·L-1浓度的5-Fu处理细胞48 h,结果显示(Fig 2),Control组的增殖抑制率分别为2.2%、4.9%、16.1%、23.2%、44.6%,DADS组的抑制率分别为4.1%、10.3%、25.1%、47.4%、58.6%,高于Control组(P<0.01),表明DADS能增强5-Fu对细胞增殖的抑制作用;VCR组的增殖抑制率分别为0.2%、0.8%、1.5%、3.1%、4.4%,低于Control组(P<0.01),说明VCR耐药细胞对5-Fu的敏感性降低;VCR+DADS组的抑制率分别为1.9%、3.5%、7.4%、20.3%与29.4%,高于VCR组(P<0.01),说明DADS能增强VCR耐药细胞对5-Fu的敏感性;DJ-1组的增殖抑制率分别为1.1%、3.1%、12.1%、17.8%、35.8%,低于Control组(P<0.05),表明过表达DJ-1导致细胞对5-Fu的敏感性下降;DJ-1+DADS组的抑制率分别为2.3%、7.4%、17.3%、30.9%、51.0%,高于DJ-1组(P<0.01),说明DADS能提高DJ-1过表达细胞对5-Fu的敏感性。

Fig 2 DADS augmented 5-Fu-induced proliferative inhibition of VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

2.3 DADS诱导DJ-1过表达细胞和VCR耐药细胞凋亡如Fig 3所示,VCR组、DJ-1组凋亡率分别为1.7%和3.2%,均低于Control组6.5%(P<0.01),表明VCR耐药细胞和过表达DJ-1细胞表现凋亡抑制;DADS组、VCR+DADS组、DJ-1+DADS凋亡率为13.9%、8.1%、10.26%,分别高于Control组、VCR组、DJ-1组(P<0.01),表明DADS不仅诱导Control组细胞凋亡,而且能诱导DJ-1过表达细胞和VCR耐药细胞凋亡。

2.4 DADS对DJ-1过表达细胞和VCR耐药细胞耐药相关基因表达的影响与Control组比较,VCR组和DJ-1组MDR-1、Bcl-2、XIAP的mRNA水平明显上调,caspase-3 的mRNA水平明显下调(P<0.01)(Fig 4);VCR组和DJ-1组P-gp、Bcl-2、XIAP蛋白水平增高,caspase-3 蛋白水平降低(P<0.01)(Fig 5),表明DJ-1影响耐药相关基因表达;与Control组比较,DADS组MDR-1、Bcl-2、XIAP基因表达下调(P<0.05),caspase-3上调(P<0.01)(Fig 4,5);DADS降低VCR耐药、DJ-1过表达细胞MDR-1、Bcl-2、XIAP基因表达(P<0.05)、升高caspase-3表达(P<0.01)(Fig 4,5),表明DADS能调节VCR耐药、DJ-1过表达细胞耐药相关基因表达。

2.5 免疫荧光检测耐药相关分子表达检测结果显示(Fig 6),与Control组比较,DADS组P-gp、Bcl-2、XIAP表达降低、caspase-3表达升高;与Control组比较,DJ-1组和VCR组P-gp、Bcl-2、XIAP表达增加、caspase-3表达减少;与VCR组比较,DADS能下调VCR耐药细胞P-gp、Bcl-2、XIAP表达、上调caspase-3表达;与VCR+DADS组相比,DADS对DJ-1过表达细胞发挥着同样的作用。

Fig 3 Apoptosis induced by DADS in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

Fig 4 Effect of DADS on mRNA levels of drug-resistance associated genes in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

Fig 5 Effect of DADS on protein expression of drug-resistance associated genes in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

3 讨论

DADS抗乳腺癌细胞耐药作用及机制的研究报道较多,它通过调节信号通路影响耐药相关基因表达、改善乳腺癌细胞耐药[10]。例如,DADS抑制紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡作用与其促进活性氧释放、下调细胞膜CD151(侵袭转移相关分子)表达有关[11]。目前,DADS抗胃癌细胞耐药作用及机制有待研究。

Fig 6 Expression of drug resistance related molecules detected by immunofluorescence(×400)

本研究结果显示,DADS能增强非耐药SGC7901细胞对5-FU的敏感性;与非耐药细胞比较,VCR组细胞对5-FU的敏感性明显降低,DADS能改善5-FU 对VCR耐药细胞增殖的抑制作用,说明DADS能增强VCR耐药细胞对5-FU的敏感性。有研究报道,VCR耐药SGC7901细胞DJ-1的表达显著高于非耐药细胞,在非耐药细胞过表达DJ-1可导致细胞对多种化疗药物耐药[8]。我们分析,DADS改善VCR耐药细胞对5-FU的敏感性可能与其拮抗DJ-1介导的耐药有关。为此,我们接下来观察DADS是否能拮抗DJ-1过表达介导的耐药。

DJ-1在肿瘤中表达异常增高可导致许多信号通路(PI3K/AKT、ERK1/2、MEKK1/SEK1/JNK1、Wnt/β-catenin、雄激素受体等)过度激活,它是调节各种类型癌症细胞恶性表型的关键因子,也是肿瘤细胞建立多药耐药机制的重要调节分子,它作为潜在的抗肿瘤治疗靶点已引起广泛的关注[5-6]。

DJ-1高表达与胃癌临床进展、转移、预后差呈正相关[12]。过表达DJ-1诱导多药耐药的胃癌细胞表型[8]。siRNA下调DJ-1表达可提高阿霉素耐药乳腺癌MCF-7细胞对阿霉素的敏感性[13];DJ-1在多药耐药小细胞肺癌细胞的表达明显高于非耐药细胞,DJ-1-siRNA能恢复耐药细胞对阿霉素、顺铂、依托泊苷的敏感性,增强药物抑制增殖和诱导凋亡作用[14]。本研究结果显示,DJ-1过表达细胞对5-FU的敏感性降低,且细胞凋亡率低于非耐药细胞,与VCR耐药细胞相似,说明细胞对5-FU的敏感性降低与DJ-1过表达有关;DADS下调DJ-1表达的同时,增强5-FU对DJ-1过表达细胞的增殖抑制作用,并且DADS诱导DJ-1过表达细胞凋亡与其诱导VCR耐药细胞凋亡作用相似,表明DADS抗DJ-1介导的胃癌细胞耐药与其下调DJ-1表达有关。

P-gp是MDR-1基因表达的药物转运蛋白,通过泵出药物分子导致多药耐药;Bcl-2具有抗凋亡作用;过表达DJ-1可使胃癌细胞P-gp、Bcl-2表达上调,敲低DJ-1表达可增加细胞对阿霉素、顺铂、VCR、5-FU的敏感性[8]。我们用DADS处理VCR耐药、DJ-1过表达细胞,观察耐药相关基因表达的变化。结果显示,DJ-1过表达细胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白水平以及Bcl-2表达均高于Control组,与VCR耐药细胞相似;DADS能降低这两种细胞P-gp、Bcl-2表达。文献报道,DJ-1通过PTEN/PI3K/Akt/Nrf2 通路上调P-gp、Bcl-2表达、诱导胃癌细胞耐药[15]。我们分析,DADS抑制P-gp、Bcl-2表达与其下调DJ-1有关;DADS下调DJ-1是否影响PTEN/PI3K/Akt/Nrf2及其他信号通路、发挥抗耐药作用还有待证实。

XIAP是凋亡抑制蛋白家族成员之一,它不仅通过失活caspases抑制凋亡、还通过调节信号通路介导肿瘤细胞耐药[16]。我们之前证实,DADS通过MicroRNA-7下调XIAP、抑制胃癌细胞增殖[17]。DJ-1通过PTEN/AKT通路增强黑色素瘤细胞增殖、侵袭能力,敲低DJ-1可降低survivin,升高caspase-3、Bax、p53、Daxx表达,说明DJ-1调节凋亡相关基因表达[18]。本实验结果显示,过表达DJ-1细胞中XIAP表达增高、caspase-3表达减少,与VCR耐药细胞相似;DADS能降低XIAP、增加caspase-3表达,说明DADS增强DJ-1过表达细胞对5-FU的敏感性与其拮抗DJ-1对XIAP、caspase-3表达的影响有关。

综上,DADS能抑制DJ-1过表达细胞P-gp、Bcl-2、XIAP表达、诱导caspase-3表达,增强细胞对5-FU的敏感性,DADS的增敏作用与其下调DJ-1表达有关。DADS是多靶点活性药物,其抗肿瘤耐药机制可能涉及多个方面[10]。因此,DADS抗胃癌细胞耐药机制还需进一步研究。