快速老化SAMP6小鼠骨代谢及其分子机制研究进展

马绍勇,杨 梦,王佳佳,杨亚军

(广东医科大学药理学教研室,广东天然药物研究与开发重点实验室,广东 湛江 524023)

老年性骨质疏松(senile osteoporosis,SOP)及其所致脆性骨折是医疗费升高的原因之一。年老体衰,骨量渐失,骨质量下降,但SOP症状隐匿,后果严重,诊疗滞后[1]。因此,尽早地预防、诊断和治疗SOP,是老龄化社会亟待解决的重要问题之一。SOP的发病过程复杂,机制未明,目前仍需凭借实验动物开展广泛而深入的研究,根据需要可以选择自然衰老性SOP模型、快速老化SOP模型和D-半乳糖致衰老性SOP模型[2]。自然衰老性SOP模型存在死亡率高、管理成本高、实验周期长等诸多弊端,而快速老化小鼠P6品系(senescence accelerated mouse prone 6,SAMP6)小鼠是通过AKR/J系小鼠近交繁殖培育出的一种模型小鼠,具有衰老快、寿命短(平均约7.9个月)、骨骼早衰等特征,表现为骨微结构受损、骨量减少和骨脆性增加,是目前公认的SOP模型之一[3]。本文综述了SAMP6小鼠骨骼的力学性能、微结构和基质组成,并总结了遗传基因、功能分子等与骨代谢相关的机制。

1 SAMP6小鼠的骨生物力学性能

骨生物力学性能是评估骨质量的直接可靠方法,可用于评价骨骼在受外力作用后的力学特性和生物效应。相比于SAMR1小鼠,SAMP6小鼠在整体上显示较差的力学性能。全骨模量降低了23%,屈服强度降低了37%,极限强度降低了40%,全骨韧性降低了62%。此外,SAMP6小鼠的胫骨硬度和弯曲矩减少了20%～25%。在股骨方面,屈服力矩和最终力矩分别减少了20%和35%,关节位移和骨折能量减少了70%[4]。这些结果表明,SAMP6小鼠的胫骨和股骨易碎、韧性差、抗骨折能力较弱。然而,与胫骨和股骨不同的是,SAMP6小鼠的椎骨在力学性能上与SAMR1小鼠相比,差异无显著性。尽管椎骨骨小梁体积减少,但这一变化被骨质矿化和皮质骨厚度的增加所抵消[5],说明椎骨和四肢骨在力学性能上存在差异。进一步观察四肢骨,相比于SAMR1小鼠,SAMP6小鼠的股骨和胫骨的皮质骨模量增加了8%,硬度增加了11%。此外,股骨的皮质骨模量和硬度均高于胫骨[6],表明SAMP6小鼠的皮质骨矿化程度高,且硬度较大。另有研究发现,低、中、高强度运动可以提高SAMP6小鼠股骨的断裂强度,从而改善其生物力学性能[7]。这一发现对于预防和治疗骨质疏松症具有重要意义。总之,SAMP6小鼠在整体和四肢骨方面均表现出较差的生物力学性能特征。

2 SAMP6小鼠的骨微结构特征

从整体来看,SAMP6小鼠与SAMR1小鼠在椎骨高度、股骨、胫骨长度、骨组织重量等方面,差异无显著性,但骨组织微结构的各项指标均发生了不同程度的改变。在椎骨方面,随着年龄增长,SAMP6小鼠的椎骨总面积和骨内面积增加了15%和38%,而皮质骨厚度减少了18%[5]。此外,SAMP6小鼠椎骨的骨小梁体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)在不同区域呈现差异,中部区域小于1%,而顶端和尾端比SAMR1小鼠减少了35%。SAMP6小鼠的骨小梁结构模型指数(structure model index,SMI)明显高于SAMR1小鼠[5]。这表明椎骨在不同区域的骨小梁变化不同,且骨小梁形状发生了改变。在股骨和胫骨方面,SAMP6小鼠的骨髓腔面积、骨内膜周长和骨外膜周长均高于SAMR1小鼠,但皮质骨面积和厚度差异无显著性[8]。然而,股骨和胫骨松质骨中的骨小梁发生了不同变化。与SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠的股骨BV/TV下降了15%～16%,骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)也明显降低,而骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,TB.Pf)则明显增加。SAMP6小鼠的胫骨中BV/TV下降了18%,同时Tb.N、Tb.Th、SMI、TB.Pf与股骨的变化趋势相似[9]。这表明SAMP6小鼠的股骨、胫骨与SAMR1小鼠相比,在外观上没有明显差别,但骨组织微结构中的骨小梁数量减少,分离度增大,杆状结构增多,骨微结构受到了一定程度的损伤。

骨形态计量学参数进一步说明了SAMP6小鼠的骨量和骨形态的变化。与3月龄SAMR1小鼠相比,同龄的SAMP6小鼠股骨的骨小梁吸收表面长度、骨矿沉积率和骨小梁面积明显减少,表明SAMP6小鼠具有骨吸收活跃、骨形成减少和低骨量的特点。与3月龄SAMP6小鼠相比,6月龄SAMP6小鼠的皮质骨宽度平均数和类骨质面积明显减少,表明随着年龄的增加,骨质疏松程度进一步加重。这些骨形态计量学参数显示SAMP6小鼠骨微结构受到了破坏,是骨吸收加快和骨形成减少共同作用的结果[10]。

综上所述,SAMP6小鼠的椎骨、股骨和胫骨与SAMR1小鼠在外观上无明显差异,但出现骨微结构损坏、骨代谢失衡、骨量低下等骨质疏松的发病特征,且严重程度随年龄增加进一步加剧。

3 SAMP6小鼠的骨基质组成成份

骨基质由有机质和无机质组成。有机质中的胶原纤维占90%以上;无机质主要由钙、磷、镁等成分组成,以羟磷灰石结晶的形式存在。骨密度(bone mineral density,BMD)是评价骨矿含量水平的国际金标准之一[11]。在SAMP6小鼠骨骼的有机质中,总蛋白减少5%,胶原含量减少13%,且定向性较差[12]。在无机质方面,SAMP6小鼠的骨钙、骨磷水平明显降低,而血钙、血磷水平明显升高,表明骨骼的无机质流失加快。SAMP6小鼠的椎骨灰分增加18%,有机含量降低11%,水分降低了28%,表明其椎骨矿化程度更高[5]。SAMP6小鼠的BMD测量结果表明,头部区域的BMD最高,其次是脊柱、尾巴和腿部[13]。在1月龄时,SAMP6小鼠全身的BMD与SAMR1小鼠相比差异无显著性,但在2月龄时开始低于SAMR1小鼠;两者的全身BMD在4～5月龄时达到峰值,SAMP6小鼠的峰值较低。然而,SAMP6小鼠的全身骨矿含量和骨组织面积持续增加至8月龄[14],原因未明。总之,随着年龄增加,SAMP6小鼠的胶原和总蛋白含量降低,而灰分和矿物质含量增加,这种无机质和有机质水平的变化对于研究SOP提供了重要参考。

4 SAMP6小鼠的骨代谢细胞和功能分子

骨髓中存在多种与骨代谢相关的细胞,包括骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)、骨骼干细胞(skeletal stem cells,SSCs)、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞等,在骨代谢中均发挥重要作用。与SAMR1小鼠相比,1～2月龄SAMP6小鼠BMSCs数量差异无显著性,在3～4月龄时,BMSCs数量减少,并伴随骨形成下降和骨量减少[15]。在衰老过程中,SAMP6小鼠的骨细胞和成骨细胞衰退,出现线粒体肿胀和髓鞘样结构[16],破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶阳性率较高,破骨活性增强[17],过氧化物酶体增殖物激活物γ的表达增加,脂肪细胞分化增强[18]。体外培养的SAMP6小鼠BMSCs的细胞增殖和代谢活性降低,细胞凋亡比例增高,成骨分化潜能受损,脂肪分化能力增强[15,19-20]。这些现象提示,SAMP6小鼠的BMSCs出现衰老的特征。总之,SAMP6小鼠骨量低下是多种细胞共同作用的结果。近年来,SSCs对骨骼发育和修复的作用越来越受到重视,但其在SAMP6小鼠中的研究尚未见报道。

SAMP6小鼠的骨代谢过程受到多种因素的调控,其中甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是重要的参与者之一。与SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠的甲状旁腺分泌颗粒数量增加,甲状旁腺颗粒内质网和高尔基复合体体积增加,而溶酶体体积减少[21],呈甲状旁腺功能亢进状态。此外,SAMP6小鼠的尿cAMP和尿钙水平较高,血钙、血磷和PTH水平也明显升高,提示甲状旁腺功能亢进会导致骨吸收增加,骨量减少[22]。研究表明,PTH对皮质骨和松质骨的作用相反:一方面,低剂量PTH可以增加皮质骨中c-fos的表达,促进破骨细胞成熟,增强骨吸收,抑制Ι型胶原的合成,阻碍成骨细胞介导的骨形成活动,导致皮质骨孔隙率增大,骨密度降低[23];另一方面,低剂量PTH可以改善SAMP6小鼠松质骨骨小梁微结构,增加干骺端的骨强度[24]。白介素11(interleukin 11,IL-11)作为一种抑炎因子,也会影响SAMP6小鼠的骨代谢过程。在SAMP6小鼠骨髓基质细胞中,IL-11表达减少,若增强TGF-β水平和AP-1活性,有可能促进IL-11表达的增加,破骨细胞和成骨细胞的生成也相应增强[25];补充IL-11,则会抑制成脂分化,同时会促进成骨分化与破骨分化[18]。可见,PTH的增加和IL-11的异常减少可能是导致SAMP6小鼠骨代谢异常的主要原因。

5 SAMP6小鼠的遗传基因和分子机制

SAMP6小鼠具有骨密度低下、遗传稳定的特征,其骨量主要受多个基因的共同调控,但与骨骼相关的基因位于不同染色体上。简言之,第11号染色体上的位点可以调控骨内膜和骨膜的形成,从而影响股骨横断面的形状。13号染色体上的Pbd2位点与成熟前的骨形成有关,是增加峰值骨密度的位点,并能增加干骺端的骨小梁和皮质骨体积,但不影响骨骼的几何形状[26]。X染色体上的Pbd3位点与成熟后的骨丢失率相关,但不影响峰值骨量[27]。

Wnt/β-catenin信号通路在骨形成调控中扮演着重要角色。低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6和Frizzled受体与Wnt结合,促进β-catenin转位入核,与TCF/LEF转录因子相互作用,最终激活成骨细胞的分化[28]。分泌型卷曲相关蛋白4(secreted frizzled-related protein 4,SFRP4)作为受体阻遏物,妨碍Wnt信号在细胞内的传递,抑制成骨分化,导致骨密度下降。在SAMP6小鼠中,SFRP4的表达水平明显增高,影响骨代谢过程。然而,在松质骨和密质骨中,SFRP4的作用途径并不一致。松质骨缺失SFRP4基因,典型的Wnt信号通路激活,骨小梁数量增加;皮质骨缺失SFRP4基因,通过激活非典型的Wnt通路,增强BMP信号,导致硬化蛋白表达增加,皮质骨变薄[29]。低剂量PTH和IL-11通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进骨形成。研究表明,PTH通过抑制MEF2C的表达,降低骨硬化蛋白(sclerostin,SOST)的表达,从而促进Wnt信号传递,增加骨密度。另据报道,IL-11通过抑制Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-related protein 1,DKK1)和DKK2的表达,激活Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞分化[30]。然而,在SAMP6小鼠中,IL-11是否通过DKK1和DKK2来激活Wnt/β-catenin信号通路,目前尚不明确(Fig 1)。

Fig 1 SAMP6 mouse bone metabolism-related

综上所述,SAMP6小鼠是一种用于研究SOP分子机制的模型。尽管已经取得了一些进展,但仍需要进一步的研究来揭示SAMP6小鼠SOP的详细机制和潜在治疗靶点。

6 总结与展望

SAMP6小鼠具有遗传稳定、骨量低下等特点,在骨骼形态、结构组成和BMD力学性能方面均与人类相似,椎骨除外。SAMP6小鼠骨量低下的原因较为复杂,根据现有的研究报道,其发病机制可能与BMSCs衰老、成骨细胞减少、破骨细胞与脂肪细胞增多、IL-11和PTH表达异常有关。目前,以SAMP6小鼠作为模型研究与开发防治SOP的药物,已经取得了一系列研究成果,尤其是抗骨质疏松中药及其天然产物。例如,黄芪可以通过Vitamin-D/FGF-23/Klotho通路影响骨形成活动,进而提高钙、磷含量,改善SAMP6小鼠骨质疏松[31]。白藜芦醇能够增强线粒体功能,改善细胞代谢,促进成骨分化,从而增加SAMP6小鼠的骨形成功能[32]。肉苁蓉总糖苷和肉苁蓉多糖可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路,改善SAMP6小鼠的骨质疏松症状[33]。此外,小檗碱、干发酵大豆食品、膳食根皮苷、补肾壮骨颗粒均可提高SAMP6小鼠BMD,对SOP具有很好的治疗潜力。前述研究为解决老龄化社会中SOP问题提供了有希望的治疗策略,并促进了对SOP发病机制的深入了解,为未来进一步研究和临床应用奠定了基础。