COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA及血清cTnT、尿酸水平变化分析

云俊杰,徐 影

(上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海 200021)

世界卫生组织发布的数据[1]显示,慢性阻塞性肺疾病(COPD)的死亡率呈逐年上升趋势,至2020年已位居世界常见致死性疾病的第3位,致残率位居第5位。随着COPD病情反复急性发作和进展,最终合并肺动脉高压,进而发展为慢性肺源性心脏病,威胁患者的生命安全[2]。因此,准确评估COPD急性加重期患者的预后十分重要。细胞因子信号抑制蛋白-1(SOCS-1)是一种抑炎因子,在人体天然免疫中发挥负反馈调节作用,维持炎症反应平衡[3]。Toll 样受体4(TLR4)可能通过促进气道炎症因子释放,加速黏蛋白分泌,参与COPD的发病机制[4]。心肌肌钙蛋白T(cTnT)是心肌损伤的标志物,COPD患者合并的低氧血症、炎症反应异常、感染等均可能引发心肌损伤[5]。尿酸在人体中发挥抗氧化作用,缺氧、异常炎症反应等情况下会导致尿酸水平升高[6]。本研究主要探讨外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平变化在COPD急性加重期的意义,为COPD的临床诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年3月-2021年9月上海交通大学医学院附属第九人民医院收治的COPD急性加重期患者70例(COPD急性加重期组),COPD稳定期患者40例(COPD稳定期组)。COPD急性加重期组男41例,女29例;年龄58～82岁,平均(70.28±5.64)岁。COPD稳定期组男24例,女16例;年龄55～80岁,平均(69.71±5.95)岁。另收集健康志愿者40名为对照组,其中男23名,女17名;年龄57～76岁,平均(69.03±5.11)岁。各组研究对象的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会审核批准。

入选标准:符合慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD2016)中的诊断标准[7];能够正常沟通,可配合完成1 a随访。

排除标准:合并自身免疫系统疾病、严重感染性疾病患者;恶性肿瘤、痛风、严重支气管哮喘、严重支气管扩张患者;合并精神疾病、神经功能严重异常患者。

1.2 主要试剂

Ficoll淋巴细胞分离液(上海翌圣生物科技股份有限公司);RNA提取试剂盒(Trizol法)(上海爱必信生物科技有限公司);cDNA合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司);PCR HS Taq、SYBR Green Kit、PrimeSTAR®HS DNA Polymerase、dNTP(上海金畔生物科技有限公司);cTnT检测试剂盒、尿酸检测试剂盒(江苏恩莫阿赛生物技术有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 外周血单个核细胞中SOCS-1、TLR4 mRNA水平检测

采集各组研究对象的空腹肘静脉血5 mL,肝素抗凝,使用Ficoll淋巴细胞分离液抽提外周血中单个核细胞。RT-PCR法检测SOCS-1、TLR4 mRNA水平:取外周血单个核细胞,按1 mg/μL的比例加入预冷的Trizol提取总RNA,反转录得到cDNA,-20 ℃保存备用。PCR扩增按照试剂盒说明书进行。SOCS-1上游引物5′-AGTTCCGAAA AGGTAGGTTG-3′,下游引物5′-GAAGTAGACGATGACG GGTTA-3′;TLR4上游引物5′-TCTGAGGACAAGAC GACCAAC-3′,下游引物5′-GAAGTAGACGATGAC GGGTTA-3′;β-actin上游引物5′-CCTACCG ATGCA TGTACCGA-3′,下游引物5′-GACAGCGGGTAGATA CTCCC-3′。PCR反应体系20 μL:10×Reaction Buffer 3 μL,cDNA模板1 μL,dNTP 2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,Taq酶0.5 μL,双蒸馏水11.5 μL。PCR反应条件:95 ℃变性1 min,95 ℃ 变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共40个循环。以β-actin为内参计算相对表达量。

1.3.2 血清cTnT、尿酸浓度及肺功能检测

采集各组研究对象的空腹肘静脉血4 mL,室温下静置10 min,3 000 r/min离心10 min,收集血清,-20 ℃保存待测。电化学发光法测定血清cTnT浓度,尿酸酶-过氧化物酶法测定血清尿酸浓度。使用肺功能检测仪检查3组研究对象的FEV1(第1秒用力呼气量)、FEV1%(第1秒用力呼气量占预计值比例)、FEV1/FVC%(第1秒用力呼气量占用力肺活量比例)。

1.3.3 随访观察

出院后对COPD急性加重期患者进行1 a的随访,前3个月每月进行1次电话随访,3个月进行1次门诊随访;第4至第12个月每2个月进行1次电话随访,第12个月进行1次门诊随访;记录患者不良预后(病情复发再入院、死亡)情况,纳入预后不良组,其余患者纳入预后良好组。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平

本研究结果显示,外周血单核细胞中SOCS-1、TLR4 mRNA水平在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);COPD急性加重期组SOCS-1 mRNA水平明显低于COPD稳定期组和对照组,COPD稳定期组明显低于对照组(P<0.05);COPD急性加重期组TLR4 mRNA水平明显高于COPD稳定期组、对照组,COPD稳定期组明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组外周血单核细胞外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 的mRNA水平Tab.1 SOCS-1 and TLR4 mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells of each group

2.2 各组血清cTnT、尿酸水平

本研究结果显示,COPD急性加重期组血清cTnT、尿酸水平明显高于COPD稳定期组和对照组,COPD稳定期组血清cTnT、尿酸水平明显高于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 各组血清cTnT、尿酸水平Tab.2 Levels of serum cTnT and uric acid in each group

2.3 各组肺功能水平

本研究结果显示,COPD急性加重期组FEV1、FEV1%、FEV1/FVC%明显低于COPD稳定期组和对照组,COPD稳定期组FEV1、FEV1%、FEV1/FVC%明显低于对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 各组肺功能水平Tab.3 Lung function levels among different groups

2.4 COPD急性加重期患者FEV1/FVC%与外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平相关性分析

Pearson相关性分析显示,COPD急性加重期患者FEV1/FVC%与外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA表达水平呈正相关关系(P<0.01),与外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达水平及血清cTnT、尿酸浓度呈负相关关系(P<0.01)。见表4。

表4 COPD急性加重期患者FEV1/FVC%与外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 的mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平相关性分析Tab.4 Correlation analysis between FEV1/FVC% and peripheral blood mononuclear cell SOCS-1,TLR4 mRNA,serum cTnT and uric acid levels in patients with acute exacerbation of COPD

2.5 不同预后的COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平

70例COPD急性加重期患者中预后不良14例(20.00%),预后不良组COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA表达水平明显低于预后良好组,TLR4 mRNA表达水平明显高于预后良好组(P<0.05);预后不良组血清cTnT、尿酸水平明显高于预后良好组(P<0.05)。见表5。

表5 不同预后的COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4的 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平Tab.5 Peripheral blood mononuclear cell SOCS-1,TLR4 mRNA,serum cTnT and uric acid levels in patients with acute exacerbation of COPD with different prognosis

2.6 外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平对COPD急性加重期患者预后的评估价值

以外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平变化评估COPD急性加重期患者预后的敏感度为纵坐标,以特异度为横坐标,构建ROC曲线,结果显示,外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平对COPD急性加重期患者预后均具有较高的评估价值(P<0.05);其中外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA及血清cTnT、尿酸联合检测的评估价值最高(AUC=0.964),灵敏度、阳性预测值明显高于各指标单独检测。见图1、表6。

图1 外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平对COPD急性加重期患者预后评估价值Fig.1 Peripheral blood mononuclear cells SOCS-1,TLR4 mRNA and serum cTnT, uric acid for prognostic evaluation in patients with acute exacerbation of COPD

表6 外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平对COPD急性加重期患者预后评估价值Tab.6 Evaluation value of peripheral blood mononuclear cell SOCS-1,TLR4 mRNA,serum cTnT and uric acid on the prognosis of patients with acute exacerbation of COPD

3 讨 论

COPD发病机制复杂,急性发作时存在较高的死亡率[8],准确评估患者预后对治疗方案选择具有重要的参考价值。生化指标具有检测方便、费用较低、易重复等优点,在COPD急性加重期患者病情和预后评估中的应用价值是目前研究热点之一[9]。近年来研究[10]发现,天然免疫系统功能异常参与COPD的发生与发展中,模式识别受体是人体重要的天然免疫受体之一,能够促使免疫应答快速展开。Toll样受体是一类重要的模式识别受体,广泛分布于巨噬细胞、肺泡上皮细胞等细胞的细胞膜、细胞质、溶酶体膜上[11];在天然免疫反应的启动以及适应性免疫反应的诱导中发挥重要作用,是固有免疫与适应性免疫连接的桥梁[12]。TLR4是首个在人体中发现的Toll样受体,是固有免疫细胞表面的病原模式识别受体。近年来研究[13]发现,TLR4信号通路激活参与肺部疾病的发生与发展。SOCS-1作为一种抑炎因子,是肺泡上皮细胞炎症反应的负性调节因子,此外其在天然免疫反应中也发挥负反馈调节作用,可通过调节白细胞介素、干扰素等细胞炎性因子的信号传导,维持人体中炎症反应平衡状态[14]。结合本研究结果可知,在COPD患者中SOCS-1低表达、TLR4高表达,且随着病情严重程度的增加上述改变越发明显。

本研究中与COPD稳定期患者和健康志愿者比较,COPD急性加重期患者血清cTnT、尿酸水平明显升高(P<0.05)。cTnT水平升高提示心肌损伤,COPD急性加重期患者多合并低氧血症[15];此外机体炎症反应异常、感染、心功能不全等因素均可能引发心肌损伤、cTnT水平升高[16]。cTnT水平越高提示心肌损伤程度越重,患者不良预后的发生风险越大。尿酸可清除自由基,具有抗氧化作用,在呼吸道上皮液中可检出较高浓度,当人体组织处于缺氧、氧化应激状态、慢性炎症状态时尿酸水平升高,其水平升高与COPD急性加重期患者死亡率密切相关[17]。本研究中COPD急性加重期患者FEV1/FVC%与外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA表达水平呈正相关关系,与外周血单个核细胞TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平呈负相关,提示外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平与COPD急性加重期患者病情进展密切相关。ROC曲线分析显示,外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平联合检测对COPD急性加重期患者预后具有较高的评估价值,可作为参考指标用于患者治疗方案的制定,以提升COPD急性加重期患者的预后水平。

综上所述,COPD急性加重期患者外周血单个核细胞SOCS-1、TLR4 mRNA水平及血清cTnT、尿酸水平联合检测对患者预后具有较高的评估价值。