嗜果刀孢菌寄主范围的测定及PCR 快速检测

陈帅康，王彩霞，施万斌，鲁海龙，董安昊，刘楚丽，马 荣

(新疆农业大学林学与风景园林学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

野杏（Prunus armeniacaL.）是天山野果林原始植物区系组成物种之一，对维持稳定的野果林生态系统起着重要作用[1]。近年来，由于人类活动、病虫害大面积发生等原因，导致野果林受损严重，野杏也受害较重，未能幸免。其中，病害以真菌性穿孔病对野杏叶片和果实的为害最为严重。通过前期研究发现引起野杏真菌性穿孔病的病原为嗜果刀孢菌（Wilsonomyces carpophilus），属于子囊 菌 门 （Ascomycota ） ， 座 囊 菌 纲（Dothideomycetes ） ， 格 孢 菌 亚 纲（Pleosporomycetidae ）， 格 孢 腔 菌 目（Pleosporales），科（Dothidotthiaceae），嗜果刀孢菌属（Wilsonomyces）[2-3]，该属仅包含嗜果刀孢菌一个种。由该菌引起的穿孔病是危害核果类果树的一类重要病害，最早于1843 年在法国发现，随后在美国、伊朗、澳大利亚、阿富汗、意大利、希腊、新西兰、葡萄牙、前苏联、印度以及中国[4-7]等国家均有为害。中国甘肃省自上世纪九十年代记录了由嗜果刀孢菌引起杏果斑点病的病果率高达80%[5]、桃果实褐斑病的病果率达71%[8]。2019 年，程元等调查发现新疆巩留县超过50%的杏树果实受到嗜果刀孢菌的为害[9]。2020 年，叶双华等在新疆伊犁的新源、巩留、霍城和伊宁县调查发现，野杏叶片和果实平均发病率达79.33%和53.17%[10]，严重影响杏果实的产量和品质。目前，我国的甘肃、新疆、河北、河南、安徽、江苏、四川、吉林等省份及自治区有该菌的为害记录[8-12]。

嗜果刀孢菌不仅分布广，而且危害的寄主种类也较多。该菌在全球范围内可以危害壳斗科（Fagaceae ） 栎属（Quercus） 的冬青栎（Quercus ilexL.）[13]和蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）、 樱属（Cerasus）、 稠李属（Padus）、 桃属（Amygdalus）、 梨属（Pyrus）、 花楸属（Sorbus）、 榅桲属（Cydonia）、苹果属（Malus）[4-8,12-13]等的多种植物，如：杏（Prunus armeniacaL.）、桃（Prunus persicaL.）、 李（Prunus salicinaLindl.）、桂樱（Prunus laurocerasusL.）[14]、美洲李（Prunus americanaMarshall.）[15]、扁桃（Amygdalus communisL.）、 稠李（Padus aviumMill.）、西洋梨（Pyrus communisL.）、欧亚花楸（Sorbus aucupariaMaxim.）、榅桲（Cydonia oblongaMill.）、苹果（Malus pumilaMill.）等[16]。嗜果刀孢菌在我国主要为害杏、桃、李、 东北杏（Prunus mandshurica(Maxim.)Koehne）、欧洲李（Prunus domesticaL.）、梅（Prunus mumeSiebold et Zucc.）和山樱花（Cerasus serrulata(Lindl.) G.Don）等造成叶片穿孔或果实表面形成褐斑。新疆目前仅在野杏和野生樱桃李上有嗜果刀孢菌的为害记录[5,8-10]，但新疆多数城市绿化树种和主要的经济林树种都隶属于蔷薇科[17]，嗜果刀孢菌能否对其它树种造成危害尚不明确。因而，开展该菌的寄主范围测定，对于由嗜果刀孢菌引起的穿孔病的风险评估和病害的预防具有重要意义。

国内外关于嗜果刀孢菌的研究主要集中在种类鉴定[5,8]、生物学性状[18]、病理生理[19-21]及防治等[5]。对于嗜果刀孢菌引起的穿孔病的诊断主要通过传统的组织分离法，基于形态学特征结合多片段分子生物学完成，费时费力、诊断效率低，建立嗜果刀孢菌的快速检测技术对于病害的快速、准确诊断至关重要。常规PCR 技术在植物病原菌的种类鉴定及多样性分析等方面得到广泛应用[22-23]，但其灵敏度有限。实时荧光定量PCR 技术具有高效、高特异性、高灵敏度和定量分析等特点，在植物病原物检测及流行学方面的研究得到了广泛应用[24]。王瑜等基于腐皮镰刀菌的tef1(translation elongation factor 1-alpha）基因建立了该菌的实时荧光定量PCR 快速检测方法，提高了中药材根腐病的检出率[25]。谢学文等根据三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因序列设计引物，建立了茄匍柄霉菌的qRT-PCR检测体系，能快速准确定量检测土壤病残体中茄匍柄霉菌的含量[26]。段维军等基于向日葵黑茎菌及其近似种的ITS 序列差异构建了TaqMan-MGB 探针实时荧光快速检测方法，可用于疑似携带向日葵黑茎菌的样品检测[27]。任海英等利用杨梅凋萎病原菌异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢的ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列设计了特异性引物对，成功建立了杨梅凋萎病的常规PCR 检测方法用于该病害的检疫及防控[28]。

鉴于当前野杏嗜果刀孢穿孔病菌的潜在寄主范围尚不明确、快速检测技术较为缺乏，本研究拟通过离体叶片接种法测定该病菌在新疆乌鲁木齐常见园林绿化植物上的致病性，并设计筛选特异性引物，建立嗜果刀孢菌的分子快速检测技术体系，从而提高病害的诊断效率，为野杏真菌性穿孔病的早期检测和制定科学精准的防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 寄主范围的测定

通过调查和资料记载[17]筛选了6 科19 种乌鲁木齐常见的园林绿化树种作为供试植物范围进行测定，树种详细信息见表1。

表1 待测寄主植物列表Table 1 List of plants used in the host range study of Wilsonomyces carpophilus

本试验中选取菌株YA21 作为供试菌株。该菌株来源于野杏穿孔叶片的病组织，为通过单孢纯化法获取的纯培养菌株，并基于形态学和分子生物学明确了该菌为嗜果刀孢菌（GenBank：OQ547194）。将菌株YA21 在PDA 培养基上，28 ℃全黑暗的条件下培养5 d，在菌落边缘选取生长一致的直径为5 mm 的菌饼作为接种体，备用。

本研究采用离体叶片刺伤接种法，即每个树种选取生长一致的健康叶片10 片，无菌水冲洗后再用75%的酒精进行表面消毒，自然晾干后再用无菌的5 号昆虫针刺穿叶片，形成大小均匀的单个伤口。然后将制备的菌饼有菌丝面朝向伤口，以接种空白PDA 培养基为对照，每个处理3 个重复[10,29-30]。接种的叶片叶柄处用湿润的灭菌脱脂棉覆盖保湿，随后放入无菌的培养皿内并置于底层铺有无菌纱布的不锈钢托盘中。托盘中加入适量无菌水，保证湿度，托盘表面用保鲜膜封口，置于25 ℃培养箱中。接种48 h 后拆除接种体，于第3 d 开始每天拍照记录病斑扩展情况，用游标卡尺采用十字交叉法测量病斑长度和宽度，并按圆的面积计算病斑面积，病斑面积=π×[（长度 + 宽度）/2]2（π 取3.14），实验数据利用Microsoft Excel 2019 进行整理，利用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析第5 d 的病斑面积大小，比较差异显著性。在第13 d 将发病部位通过常规组织分离法进行病原菌再分离，通过形态学结合分子方法完成种类鉴定，以确认是否为所接种的嗜果刀孢菌。

1.2 特异性引物的设计、合成及常规PCR 检测

根据翻译延伸因子（tef1） 基因序列（GenBank：KY905684.1）[2]，基于引物设计原则通过primer premier 5.0 软件设计并筛选出一对引物W0404-14-F（5′-GGGCATTTTTGGATGGT GGG-3′），W0404-14-R（5′-TGCCCAAAGGGAT CATGGAC-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以菌株YA21 的DNA 作为标准品，通过核酸检测仪检测其DNA 浓度为5.99 ×102ng·μL-1，OD260/OD280为1.88，表明模板DNA纯度较好，可作为标准品用于后续PCR 扩增。

从新源县、霍城县和巩留县的野杏、野生樱桃李和桃的芽、叶片和果实上共收集到76 株嗜果刀孢菌，从其他6 种寄主上收集到22 株其他真菌，共计98 株真菌菌株，信息见表2，所有菌株保藏在新疆农业大学林学与风景园林学院森林保护学实验室。采用CTAB 法提取上述98 株供试菌株的DNA[31]，并用于特异性引物的检测，以ddH2O 为空白对照（CK）进行常规PCR 扩增，检测引物的特异性。常规PCR 扩增总体系为25 μL，包括2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反应程序：95 ℃预变性8 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳（120 V，25～30 min）检测后，凝胶成像系统分析结果。

表2 供试菌株及来源Table 2 The species and sources of strains in this study

1.3 实时荧光PCR 体系的建立及优化

以表2 中供试菌株的基因组DNA 为模板，实时荧光PCR 扩增总体系为20 μL，包括2 × SYBR Abstart Master Mix 10.0 μL，模板DNA 1～3 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.3～0.5 μL，ddH2O补充至20.0 μL。反应程序：95 ℃ 2.5 min，94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。为建立适合嗜果刀孢菌的实时荧光检测体系，优化模板DNA 浓度及引物浓度，设置模板DNA 用量分别为1、2、3 μL，引物用量分别为0.3、0.4、0.5 μL 进行扩增，根据熔解曲线稳定性确定最适用量。

1.4 特异性引物的灵敏度检测

将模板DNA 进行10 倍梯度稀释，设置5.99 ×10-5～5.99 × 102ng·μL-1共8 个梯度，以不同浓度的DNA 为模板，利用筛选的特异性引物进行普通PCR 扩增反应，根据琼脂糖凝胶电泳检测有无扩增片段， 评价特异性引物W0404-14-F/W0404-14-R 对不同来源嗜果刀孢菌的敏感性。

1.5 特异性引物对自然发病样品和室内接种样品的检测

于2022 年5 月，在新疆伊犁哈萨克自治州新源县杏花沟（83°26′2.133 6″～83°26′9.812 4″ E，43°32′17.995 2″～43°32′24.918 0″ N）随机采集自然发病且具有典型病症的野杏穿孔病叶片和果实样品各2 份。取100 mg 新鲜病害样本，加入液氮充分研磨成粉末，然后转移至1.5 mL 离心管中，使用Ezup 柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）提取植物基因组总DNA。产物加入Loading Buffer 混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并分析扩增结果。

将菌株YA21 活化培养后接种在健康的野杏苗木叶片上，接种方法同1.1，以接种无菌PDA作为空白对照，接种好的叶片表面覆盖无菌脱脂棉，每隔1 h 喷施无菌水保湿，每个处理6 个重复。根据前期研究结果设置接种后7、10、13、16、19、21、24 和48 h 共计8 个时间梯度取样，样品检测同1.2。

2 结果与分析

2.1 嗜果刀孢菌在不同植物离体叶片上的致病情况

结果表明：将嗜果刀孢菌通过有伤接种至19 种植物叶片上，其中新疆小叶白蜡、山桃、榆叶梅、毛樱桃、野杏、山荆子、野生樱桃李、秋子梨、黄太平、野苹果、北美海棠、杜梨、垂柳、金叶榆及丝绵木共15 种寄主植物叶片出现不同程度的病斑，且病斑大小呈现显著性差异（表3），黄果山楂、新疆杨、紫叶矮樱、鞑靼桑和对照组未表现任何症状。对接种发病的病组织再分离，所获菌株与接种菌株种类一致。

表3 嗜果刀孢菌接种不同植物离体叶片5 d 后所产生的病斑面积Table 3 The area of necrotic lesions on detached leaves of different plants inoculated by Wilsonomyces carpophilus after five days

通过对发病的叶片病斑扩展情况进行统计分析发现，嗜果刀孢菌对新疆小叶白蜡的致病力最强，接种5 d 后平均病斑面积高达28.99 mm2；对山桃、榆叶梅、毛樱桃致病力较强，平均病斑面积 ≥13.62 mm2；对野杏、山荆子、野生樱桃李、秋子梨、黄太平致病力一般，平均病斑面积介于6～10 mm2；对野苹果、北美海棠、杜梨、垂柳、金叶榆、丝绵木致病力弱，平均病斑面积≤5.06 mm2。

2.2 特异性引物的普通PCR 检测

嗜果刀孢菌属（Wilsonomyces）仅包含嗜果刀孢菌1 个种，将76 株（表2）来源于伊犁野果林4 种寄主植物发病叶片及果实上的嗜果刀孢菌和其它22 种病原真菌基于特异性引物W0404-14F/W0404-14R 进行普通PCR 扩增。结果表明，仅76 株嗜果刀孢菌能扩增出113 bp 的目的片段（图1），其它22 株真菌与CK 均未扩增出条带。

图1 基于普通PCR 对嗜果刀孢菌特异性引物的检测结果Fig.1 Specificity of common PCR with primers specific W0404-14F/W0404-14R for detection of Wilsonomyces carpophilus

2.3 实时荧光PCR 检测体系的建立及优化

利用实时荧光PCR 对嗜果刀孢菌及其它菌株进行检测，结果表明：嗜果刀孢菌YA21 有扩增曲线，其它22 株菌株均无扩增曲线（图2）。

图2 基于实时荧光PCR 技术对嗜果刀孢菌特异性引物的检测结果Fig.2 Specific primers for Wilsonomyces carpophilus based on real-time PCR

实时荧光PCR 的扩增曲线在不同的引物用量和模板DNA 用量不同时存在差异，筛选得出当模板DNA 量为2 μL、引物量为0.5 μL 时，曲线总体稳定，多条熔解曲线峰值趋近一致（图3～4）。从而，优选出最佳反应体系为：反应总体积20 μL，其中2 × SYBR Abstart Master Mix 10.0 μL，模板DNA 2.0 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，ddH2O 补充至20.0 μL。

图3 不同模板DNA 用量的熔解曲线Fig.3 Melting curves of different DNA concentrations

图4 不同引物用量的熔解曲线Fig.4 Melting curves of different primer concentrations

2.4 特异性引物的灵敏度检测

用特异性引物W0404-14F/W0404-14R 对稀释后的模板DNA 进行常规PCR 扩增，结果表明，随着模板DNA 浓度的降低，扩增出的片段条带亮度逐渐变弱，直至浓度为5.99 × 10-2ng·μL-1时无扩增片段出现，因此常规PCR 灵敏度检测下限为5.99 × 10-1ng·μL-1（图5）。

图5 不同模板DNA 浓度基于特异性引物的扩增结果Fig.5 Different template DNA concentrations were based on amplification results with specific primers

2.5 田间自然发病及人工接种样品检测

将田间采集的自然发病的野杏叶片和果实样本基于特异性引物W0404-14F/W0404-14R 进行常规PCR 扩增，均能够扩增出特异性条带，大小为113 bp，CK 未能扩增出目标片段（图6）。人工在健康的野杏苗木叶片上接种嗜果刀孢菌10、13、16、19、21、24 和48 h 后的样本DNA 基于特异性引物W0404-14F/W0404-14R 进行常规PCR扩增，均扩增出113 bp 的目标片段，接种后7 h 的样本和接种空白PDA 培养基的对照均未扩增出目标条带（图6）。

图6 接种样本及田间发病样本的PCR 扩增结果Fig.6 PCR amplification results of natural samples and inoculated samples

3 讨论

目前在伊犁地区野果林野杏上记载的穿孔病有细菌性穿孔病和真菌性穿孔病[32]，然而野杏的叶片和果实在两种不同病原菌侵染后所形成的病斑相似，在田间难以根据发病症状确定病原菌类型，通过传统的柯赫氏法则开展种类鉴定耗时较长。本研究针对嗜果刀孢菌筛选出的特异性引物能够快速准确的从野杏的叶片、果实中检测出该菌，能够有效开展病害的早期诊断。与常规PCR 扩增检测相比，实时荧光定量PCR 技术具有更高的灵敏度，且能通过标准曲线对未知模板进行定量分析，从而进一步研究病害的发展趋势与严重程度。孙柄剑等人利用小麦纹枯病的实时荧光定量体系对人工接种的小麦进行检测，发现在接种60 d 后实时荧光定量PCR 检测结果与病情指数和接种量都呈显著正相关[33]。张艳菊等人构建了黄瓜棒孢叶斑病菌的实时荧光定量PCR 体系，可检测黄瓜叶片在接种棒孢叶斑病菌后叶片中的病菌动态变化，从而了解发病情况[34]。本研究中根据嗜果刀孢菌的tef1基因序列设计特异性引物，建立了嗜果刀孢菌常规PCR 与实时荧光PCR 检测技术，灵敏度高且特异性强，常规PCR 最低可检测出样本中DNA 浓度5.99 × 10-1ng·μL-1的嗜果刀孢菌，但实时荧光定量PCR 技术研究尚有不足，仅能对未知样本内病原菌的有无及类型进行检测，后续将建立标准曲线用于嗜果刀孢菌的定量分析，为该病害的侵染程度监测提供理论依据。

实时荧光定量PCR 技术是在常规PCR 反应体系的基础上加入荧光染料或荧光标记探针，通过荧光信号的累积实现对PCR 过程的实时监测。本研究首次尝试从发病植株中检测嗜果刀孢菌，建立了利用SYBR Green 染料法检测嗜果刀孢菌的快速检测体系。TaqMan 探针法特异性高且减少了背景荧光和假阳性，但针对不同的靶序列需设计合成不同的探针，成本花费高。SYBR Green 染料法可对任何DNA 双链进行定量分析，相对探针法操作难度及成本更低，适合大批量样本分析[35]。本研究中建立的常规PCR 和实时荧光PCR 检测体系适用于发病样本及分离纯化后的嗜果刀孢菌的检测，且具有成本低廉，检测速度快等优点，在生产实践中可用于病害诊断、苗木的调运检疫检验等。

嗜果刀孢菌可侵染蔷薇科、壳斗科等多种植物，在我国多为害桃、杏等植物引发穿孔病，但有关其寄主范围测定的相关报道较少，可侵染寄主的植物种类尚不明确。本研究通过离体叶片接种测定发现嗜果刀孢菌能够侵染野苹果、黄太平、山荆子、野杏、野生樱桃李、北美海棠、榆叶梅、山桃、毛樱桃、秋子梨、杜梨、垂柳、金叶榆、丝绵木和新疆小叶白蜡15 种植物，其中嗜果刀孢菌在新疆小叶白蜡和山桃上形成的病斑面积较大，而新疆小叶白蜡是新疆各地广泛栽植的绿化树种，潜在的致病风险较大。新疆杨和黄果山楂在接种嗜果刀孢菌后未发病，这两种树种也是常见的绿化树种之一，在园林绿化植物配置时可与其它感病植物搭配，也许将有利于避免或减轻嗜果刀孢菌的发生与流行。本研究采用人工刺伤离体接种的方法对嗜果刀孢菌菌丝的致病性和寄主范围进行测定，在48 h 左右能观察到刺伤处有明显病斑。本研究在PCR 检测特异性引物试验中，在野杏活体苗木健康叶片上有伤接种嗜果刀孢菌48 h 后叶片发病，离体叶片和健康苗木叶片在刺伤接种嗜果刀孢菌后均在48 h 左右发病，接种结果一致。不同的接种方法和接种体对嗜果刀孢菌侵染待测寄主的结果可能会产生影响，本研究仅探讨了以菌饼作为接种体通过有伤接种待测寄主的结果，采用孢子悬浮液接种的方法测定嗜果刀孢菌的寄主范围有待进一步研究。值得注意的是此结果仅为室内接种测定研究，而病害的发生在田间会受到多种因素的影响，因此本研究寄主范围测定结果仅作为参考，为嗜果刀孢菌的寄主范围研究提供基础理论数据。

4 结论

本研究初步测定了嗜果刀孢菌对乌鲁木齐常见绿化树种的致病性，表明该菌对新疆主要林木具有较大的致病风险。本研究首次针对嗜果刀孢菌设计并筛选出1 对特异性强、灵敏度高的引物，能够在自然发病样本及室内接种样本中成功检测出嗜果刀孢菌，为嗜果刀孢菌引起的穿孔病的科学诊断和快速检测提供了科学依据。