薏苡仁油联合5-FU 对结肠癌HCT-116 细胞株增殖、凋亡的影响*

王 韬，费建东，聂双发，李 磊

河北北方学院附属第一医院胃肠外科，河北 张家口 075000

结肠癌属于临床发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病和人口老龄化、饮食结构与生活习惯改变等有相关性，对人类健康造成了严重威胁［1］。现阶段，临床通常采用早期根除手术后联合化疗治疗结肠癌，常见化疗药物包括奥沙利铂、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）等［2］。但研究显示，术后单独采用化疗药物治疗结肠癌对提高患者术后生存率效果不理想，故研究联合用药方式迫在眉睫［3］。薏苡仁油是从中药薏苡仁中提取的一种抗肿瘤物质，体外实验显示，薏苡仁油能有效抑制乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌以及肠癌等癌细胞生长，诱导细胞凋亡，但其发挥诱导细胞凋亡作用的具体机制尚未完全阐明［4-5］。因此，本研究探讨薏苡仁油联合5-FU 对结肠癌HCT-116 细胞增殖、凋亡的影响以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂人结肠癌HCT-116 细胞株（西南医科大学附属医院医学实验中心）；注射用薏苡仁油（浙江康莱特药业公司，批号：1503163-1，规格：400 g/瓶）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号：16000-044）；RPMI-1640 培养基（美国Gibco 公司）；5-FU（上海旭东海普药业有限公司，批号：FA160305）；碘化丙啶（美国Sigma 公司，批号：MKBP1360V）；Annexin-V/PI 凋亡试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：1030D057）；四甲基偶氮唑盐［（methyl thiazolyl tetrazdium，MTT），美国Sigma公司，批号：M2128］。

1.2 细胞培养将细胞置于含鼠源单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP 及10%胎牛血清的1640 培养基中，在37 ℃，含有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养，选择对数生长期细胞完成实验。

1.3 MTT法测定细胞增殖情况实验分组：薏苡仁油10、20、40 μL/mL组及5-FU组（50 μg/mL）、薏苡仁油10 μL/mL+5-FU 组、薏苡仁油20 μL/mL+5-FU组、薏苡仁油40 μL/mL+5-FU 组、空白对照组。将细胞按照每孔2×104标准在96 孔培养板中接种，待细胞贴壁后，加入以上各种药物，空白对照组加入等体积生理盐水，每组均设6 个副孔；培养24、48及72 h，避光条件下每孔分别加入20 μL MTT，孵育4 h 后去除MTT 与培养基，每孔分别加入150 μL DMSO，震荡处理5 min，测定各孔吸光度值（OD）。重复实验3次，取平均值。

细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD 值/空白对照组OD值）×100%

1.4 流式细胞术测定细胞凋亡情况48 h 培养后收集各组HCT-116 细胞，离心半径10 cm，1000 r/min 离心5 min，去除上清液，采用磷酸缓冲液漂洗2 次，加入碘化丙锭、AnnexinV-FITC 染液，混匀后在4 ℃环境下避光染色15 min，上机检测荧光强度。

1.5 RT-PCR 法测定生存蛋白（Survivin）mRNA 表达水平收集给药前后结肠癌细胞，提取细胞总RNA，严格按照试剂盒说明书进行扩增、逆转录操作，选择PCR产物10进行电泳，在紫外灯下摄影。

1.6 统计学方法采用SPSS 18.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人结肠癌HCT-116 细胞增殖抑制率薏苡仁油、5-FU、5-FU+薏苡仁油均对人结肠癌HCT-116细胞增殖产生一定抑制作用，且薏苡仁油浓度越高，作用时间越长，细胞增殖抑制率越高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与薏苡仁油组、5-FU 组相比，5-FU+薏苡仁油组细胞增殖抑制率更高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组人结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率（±s）

注：#表示与5-FU+薏苡仁油组比较，P＜0.05

组别细胞增殖抑制率（%）浓度（μL/mL）10 20 40 50 50+10 50+20 50+40薏苡仁油组5-FU组5-FU+薏苡仁油组72 h 43.58±4.19#50.44±4.49#61.63±3.26#54.28±2.63#69.65±2.30 78.96±2.89 83.36±3.98 24 h 28.66±1.78#34.26±1.35#38.68±2.09#37.36±2.61#48.48±0.82 54.12±2.15 59.98±2.36 48 h 40.66±3.69#43.36±2.49#52.77±1.59#46.77±4.15#63.45±2.15 71.15±2.78 80.12±2.98

2.2 人结肠癌HCT-116 细胞凋亡率薏苡仁油组、5-FU 组、5-FU+薏苡仁油组细胞凋亡率均高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；薏苡仁油浓度越高，细胞凋亡率越高，差异有统计学意义（P＜0.05）；5-FU+薏苡仁油组细胞凋亡率高于5-FU组及薏苡仁油组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组人结肠癌HCT-116细胞凋亡率及Survivin mRNA表达（±s）

表2 各组人结肠癌HCT-116细胞凋亡率及Survivin mRNA表达（±s）

注：#表示与空白对照组比较，P＜0.05；*表示与5-FU+薏苡仁油组比较，P＜0.05；-表示等体积生理盐水

组别空白对照组薏苡仁油组5-FU组5-FU+薏苡仁油组Survivin mRNA表达1.353±0.277*0.813±0.072#*0.762±0.625#*0.743±0.222#*1.721±0.328#*0.805±0.162#0.726±0.123#0.701±0.108#浓度（μL/mL）-10 20 40 50 50+10 50+20 50+40细胞凋亡率（%）4.01±0.25*20.32±1.52#*41.35±1.63#*50.98±1.56#*34.15±1.05#*69.51±2.56#72.56±2.65#79.98±2.88#

2.3 HCT-116 细胞中Survivin mRNA 表达与空白对照组比较，不同浓度薏苡仁油干预48 h 后Survivin mRNA 表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；5-FU 组Survivin mRNA 表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；5-FU+薏苡仁油组Survivin mRNA 表达较5-FU 组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

结肠癌为全球范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，常见治疗方式包括靶向治疗、放化疗、手术等［6］。蒽环类药物与5-FU为临床治疗结肠癌的常见化疗药物，但单独用药效果不理想，易产生耐药性［7-10］。本研究在5-FU 基础上联合薏苡仁油治疗结肠癌，以达高效、低毒目的。薏苡仁具有清热排脓、舒筋除痹、健脾去湿、利水消肿功效［11］。薏苡仁油为薏苡仁的活性成分，能干扰肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［12-13］。同时，薏苡仁油还能抑制血管形成及血管内皮生长因子蛋白阳性表达，进而避免肿瘤复发、转移［14］；能调节T 淋巴细胞活性、细胞因子水平，提高机体免疫功能；薏苡仁酯还能在体外直接抑制结肠癌细胞增殖，诱导其凋亡［15］。

本研究结果显示，薏苡仁油、5-FU、5-FU+薏苡仁油均对人结肠癌HCT-116 细胞增殖产生一定抑制作用，且薏苡仁油浓度越高，作用时间越长，细胞增殖抑制率越高。提示薏苡仁油不仅能抑制HCT-116 细胞生长，还能提高5-FU 对HCT-116 细胞活性、增殖的抑制作用，并具有时间-剂量依赖性。唐翠萍等［16］研究显示，薏苡仁能增强紫杉醇抑制人乳腺癌细胞增殖作用。赵娜等［17］研究发现，在吉非替尼基础上联合薏苡仁能促进人肺腺癌细胞A549 细胞凋亡。以上结果均与本研究结果相似，进一步证明薏苡仁能增强化疗效果，抑制肿瘤细胞增殖。同时，薏苡仁油浓度越高，细胞凋亡率越高；5-FU+薏苡仁油组细胞凋亡率高于5-FU组及薏苡仁油组（P＜0.05），提示5-FU 与薏苡仁油联合治疗结肠癌利于发挥药物协同作用，进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用，其作用机制可能与Survivin mRNA表达密切相关。Survivin为一种凋亡抑制蛋白，与肿瘤细胞化疗抵抗密切相关［18］。研究显示，Survivin 高表达是肿瘤细胞逃避凋亡，进而产生耐药性的重要原因［19-21］。抑制肿瘤细胞中Survivin表达，不仅能诱导肿瘤细胞凋亡，同时还能进一步增强化疗效果。本研究中不同浓度薏苡仁油干预HCT-116 细胞48 h 后Survivin mRNA表达降低（P＜0.05），提示薏苡仁油能在一定程度上抑制Survivin表达。但与空白对照组相比，5-FU组Survivin mRNA 表达升高（P＜0.05），提示5-FU可能对HCT-116细胞中Survivin表达具有诱导作用，这也可能是HCT-116细胞对5-FU产生耐药性的原因之一。但5-FU+薏苡仁油组Survivin mRNA表达较5-FU 组降低（P＜0.05），提示薏苡仁油不仅能促使HCT-116 细胞中Survivin mRNA 表达降低，同时也能促使5-FU诱导的Survivin mRNA高表达降低，推测这可能是薏苡仁油提高HCT-116 细胞对5-FU敏感性的重要机制。

综上所述，薏苡仁油能抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，诱导细胞凋亡，与5-FU 联用能发挥药物协同作用，其作用机制可能与Survivin mRNA表达下调相关，但需进一步深入探讨。