梓醇对2型糖尿病大鼠心肌纤维化及心肌细胞形态学的影响*

许 瑞，毕艳平，邹国良，王 研，史建平，张 艳

1 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2 吉林中西医结合医院，吉林 吉林 132012； 3 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种复杂的、慢性的、进展性的除控制血糖外，需要持续医学护理手段以减少多种危险因素的代谢性疾病。与正常人群比较，DM 患者发生心血管疾病的风险显著增加［1-2］。NUNODA 等［3］研究发现对于无瓣膜病、冠心病等心脏疾病的2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者，其右心室心内膜下活检显示心肌肥大，心肌间质纤维化严重。梓醇是玄参科植物地黄的有效成分之一，已证实梓醇可降低血糖，改善DM及其并发症［4］，但其作用机制尚待进一步明确。本研究以高脂高糖膳食诱导及小剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射建立T2DM大鼠模型，观察梓醇对T2DM大鼠心肌纤维化及心肌细胞形态学的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性Wistar 大鼠90 只，购自长春市亿新实验动物有限公司，动物许可证号：［SCXK（吉）2011-0004］。大鼠同室分笼饲养，实验室通风良好，温度、相对湿度适宜，12 h 光照周期，自由饮食水；普通饲料及高糖高脂饲料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。隔日更换垫料。

1.2 实验仪器Histostar 组织包埋机（美国赛默飞世尔科技公司）；HM 340E 型石蜡切片机（美国赛默飞世尔科技公司）；DP72 型显微摄像系统（日本奥林巴斯公司）；AL204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；E-Centrifuge-6d 型离心机（美国威泰克公司）。

1.3 药品与试剂链脲佐菌素STZ（美国Sigma化学公司，批号：Sigma-S0130）；梓醇（南京景竹生物科技有限公司，批号C85851-20mg）；盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023371）；柠檬酸缓冲溶液（武汉博士德公司，批号：AR0024）；转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗体、生物素标记山羊抗兔IgG、DAB 显色液（北京博奥森公司，批号：bs-0086R、SP-0023、C-0010）。

1.4 动物分组、造模与干预措施采用随机数字表法将SPF 级雄性Wistar 大鼠随机分为正常组10只和实验组80只。实验组大鼠高脂高糖饲料喂养8 周后，腹腔注射链脲佐菌素STZ 溶液15 mg/kg制备T2DM 模型。将成模大鼠根据空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、体质量随机分为模型组、二甲双胍组与梓醇低、中、高剂量组。二甲双胍组灌胃二甲双胍混悬液90 mg/kg，梓醇低、中、高剂量组分别灌胃梓醇2.5、5、10 mg/kg，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水，每日1 次，均灌胃12周［5］。

1.5 大鼠心肌组织结构及TGF-β1水平观察实验结束前1天禁食水12 h，次日上午经尾静脉采血测量各组大鼠FPG，灌胃结束后以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，沿腹正中线打开腹腔，刺破横隔膜，取出心脏，冲洗心脏内血液，滤纸吸干。然后沿心室长轴切取心室肌肉3 mm×3 mm×3 mm；迅速剪取近心尖部1/4心肌置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片；采用免疫组织化学法检测心肌TGF-β1表达；应用Image-proplus 6.0图像分析软件，校正光密度后，每组随机选取4张切片，测定TGF-β1表达阳性染色物质的平均光密度（mean optical density，MOD），MOD 是TGF-β1的蛋白相对表达量值，即积分光密度/面积（IOD SUM/area）；采用HE染色法，每组随机选取4张切片，显微镜下观察心肌组织结构。

1.6 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐，采用LSD-t检验；方差不齐用Tanbane's T2 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况至实验结束时，因灌胃不当或出现并发症等死亡大鼠共计7 只，即正常组、模型组、二甲双胍组及梓醇高、中、低剂量组分别剩余10、9、10、10、10、9只大鼠，合计存活58只。

2.2 FPG 及心肌TGF-β1水平造模后，与正常组比较，模型大鼠FPG 增高（P＜0.05），提示模型制备成功。给药结束后，与模型组相比较，梓醇高、中、低剂量组及二甲双胍组大鼠FPG 降低（P＜0.05）；与二甲双胍组比较，梓醇中、低剂量组大鼠FPG 水平升高（P＜0.05），梓醇高剂量组与二甲双胍组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各组大鼠心肌TGF-β1降低（P＜0.05）；二甲双胍组和梓醇中剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于梓醇低剂量组（P＜0.05），高于正常组和梓醇高剂量组（P＜0.05）；梓醇高剂量组与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠FPG及TGF-β1水平比较（±s）

表1 各组大鼠FPG及TGF-β1水平比较（±s）

注：a表示与正常组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05；c表示与二甲双胍组比较，P＜0.05

组别正常组模型组二甲双胍组梓醇高剂量组梓醇中剂量组梓醇低剂量组MOD（TGF-β1蛋白相对表达量）0.064±0.010 0.194±0.030a 0.125±0.013ab 0.092±0.017abc 0.139±0.036ab 0.167±0.016abc鼠数10 9 10 10 10 9造模后FPG（mmol/L）5.35±0.25 19.67±0.39a 19.80±0.36a 19.41±0.52a 19.84±0.93a 20.21±1.04a给药结束后FPG（mmol/L）5.72±0.56 20.00±0.70a 8.98±0.26ab 9.21±0.74ab 10.61±0.88abc 13.71±0.62abc

2.3 大鼠心肌组织结构各组大鼠心肌纤维、胞质、胶原纤维呈深浅不一的红色，细胞核呈蓝色。梓醇高剂量组较正常组心肌纤维、胞质、胶原纤维、细胞核无明显变化。模型组和梓醇低剂量组心肌纤维排列紊乱或不规整，局灶性溶解、断裂，甚至呈小片状分布，胞质染色不均匀，中度或轻度肿胀，部分心肌正常；部分细胞核变形，固缩，甚至碎裂消失；心肌间隙显著增宽，可见大量或少量炎性细胞或成纤维细胞。二甲双胍组和梓醇中剂量组心肌纤维排列略规整，心肌细胞核极少部分变形；心肌间隙略增宽，炎性细胞较少。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织结构（HE，×200）

3 讨论

T2DM发生机制是胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），IR 往往发生在血糖升高之前。高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射是国内外公认的实验类动物造模方法。本研究首先给予高糖高脂饲料喂养8 周造成大鼠肥胖和IR，然后腹腔注射小剂量STZ 破坏胰岛β细胞，使血糖升高［6］。持续高糖高脂饮食可增加糖尿病心血管疾病风险，且模型组大鼠包含T2DM 2 个特点：即IR 和糖脂代谢紊乱。有研究显示注射40 mg/kg以上STZ会直接损害大鼠大部分胰岛β细胞，建立T1DM 模型。本研究模拟了临床由于长期高脂高糖进食且极少运动的不健康生活方式而发生的T2DM。

据相关研究报道，经STZ 诱发T2DM 大鼠糖尿病发病8～12 周后便有心肌超微结构病理改变，6～14 周有心功能改变［7-8］。而DM 心肌病典型病理特点为心肌肥大、凋亡、微血管病变和间质纤维化，临床早期出现左心室肌肉肥厚和（或）舒张功能障碍，随着病情的进展出现以扩张型心室重塑为特点的收缩功能不全。心脏组织结构变化是研究糖尿病心肌损伤病理状态的重要依据。而心肌间质纤维化及肌原纤维重塑是DM 患者心脏组织结构损伤的主要发病机制［9-10］，其中TGF-β1是心肌纤维化的重要促发因子。正常情况下，TGF-β1会修复受损组织，抑制炎症反应及细胞增生；在高糖状态下，TGF-β1表达上调，进一步促成心肌成纤维细胞增殖、分化，加剧胶原成分累积，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例失调，抑制胶原降解［11］。本研究观察大鼠心肌组织病理切片可见正常组心肌纤维呈条束状，整齐排列，无断裂，无坏死灶；胞质均质红染，无肿胀。心肌细胞核呈圆形或椭圆形，居细胞中央；心肌间隙正常，无炎性细胞浸润。模型组大鼠高脂高糖喂养8 周后血糖升高，干预12 周，TGF-β1表达上调，心功能改变及心肌纤维排列紊乱，出现局灶性溶解、断裂，甚至呈小片状分布，胞质染色不均匀，中度肿胀，部分心肌保持正常；细胞核变形，固缩，甚至碎裂消失；心肌间隙显著增宽，炎性细胞及成纤维细胞显著增多，呈典型DM 心肌病的临床和形态学特征。

目前研究显示梓醇对心肌组织的保护作用主要通过抗氧化应激、抗炎及抗凋亡等途径实现。近年国内外研究发现，梓醇通过调控Smad2/3和NF-κB信号通路抑制TGF-β1诱导的人非小细胞肺癌细胞上皮间质转化［12］。梓醇可降低心肌TGF-β1表达，改善心肌纤维化［13］。且梓醇衍生的环烯醚萜苷可通过抑制人气道上皮细胞中TGF-β1活化酶/TNF-α/NF-κB 通路减少MUC5AC mRNA 和蛋白表达［14］。梓醇也可减少血管TGF-β1和IV型胶原mRNA和蛋白表达而改善糖尿病兔动脉粥样硬化［15］。梓醇也可通过下调大鼠肾皮质TGF-β1和CTGF mRNA 表达发挥肾保护作用［16］。本研究中梓醇各剂量组均可不同程度抑制TGF-β1表达，减少心肌纤维损伤、细胞核变形以及心肌间质的炎性细胞渗出，且高剂量组效果更优，提示梓醇的心肌保护作用可能呈剂量依赖性。

综上所述，梓醇可改善DM 心肌纤维化，减轻心肌细胞损伤，推测梓醇可能为保护心肌细胞的有效手段。而梓醇是否还有其他保护心肌细胞的分子机制仍需进一步探讨。