电针对布比卡因中毒大鼠心肌损伤及线粒体功能的影响*

张斌森，张笑佳，秦晓宇，王春爱

1 甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2 甘肃省中医院麻醉科，甘肃 兰州 730050

布比卡因（bupivacaine，BPV）是一种通过阻滞钠离子沿轴突内流发挥镇痛作用的局部麻醉药［1］，过量或误入血管可引起严重的心脏功能衰竭，且常见抗心力衰竭药物复苏困难［2-3］。本课题组前期研究发现电针内关穴可以保持线粒体结构的完整性，改善线粒体功能，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS），有效缓解心肌毒性［4］，但降低ROS 的具体机制尚未明确。因此，本研究通过持续静脉泵注射的盐酸BPV 建立大鼠心肌损伤模型，探讨电针内关穴抗心肌损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、分组与取材SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠30 只，体质量250～300 g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，且经甘肃省中医药大学伦理委员会批准（2021-200）。参照《关于善待实验动物的指导意见》处理大鼠。用3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后将大鼠仰卧位固定于手术台上，暴露大鼠左侧股静脉，置24 G 套管针用于给药；连接电极监测标准Ⅱ导联心电图，监测心电图及心率（heart rate，HR）；暴露右侧颈动脉，置24 G套管针用于监测动脉血压。

采用随机数字表法将大鼠分为3 组：对照组（A组，n=10），以0.9%生理盐水3 mL（kg/min）静脉滴注，30 min 后处死；布比卡因组（B 组，n=10），先静脉滴注生理盐水30 min，再滴注0.5%布比卡因2 mg/（kg·min）至心脏骤停；电针组（E 组，n=10），大鼠在电针刺激内关穴30 min 后静脉滴注5%布比卡因，同时于前肢内侧，距离腕关节约3mm 的桡尺骨缝间，采用0.25 mm×13 mm 毫针垂直角度刺入2～3 mm，所有针头末端分别连接电针仪，2/100 Hz 疏密波，强度为1 mA，以穴位周围肌肉出现轻微颤动为宜。

实验结束后对大鼠实施安乐死，并行心脏灌注，取大鼠心肌组织待测。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 盐酸布比卡因注射液（上海朝辉药业有限责任公司，批号：1805J01）；BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝公司，批号：PC0020）；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181008）；GENMED 纯化线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）光度法检测试剂盒（批号：GES10095.3）、GENMED动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒（GENMED SCIENTIFICS INC，批号：GES10006.2）；Fluo-3/AM、胶原酶、二氢乙啶（dihydroethidium，DHE）染料（均购自YESEN，货号：40703ES50、40507ES60、0102ES02）。

1.2.2 主要仪器 ZZB-1/Ⅱ型微量注射泵（江苏爱朋医疗科技有限公司）；SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；iMEC8 Vet 型兽用便捷式多参数监护仪（深圳迈瑞生物医疗电子公司）；AE610型数字心电图机（博士医药科技有限公司）；DW-HL528 型高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；SK-O180-E型超低温冰箱（中科美菱低温科技公司）；iMark型酶标仪（美国Bio Rad公司）；DNP-9022型恒温培养箱（上海精宏设备公司）；LDZX-50KBS 型灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；JD-DB 型Langendorff离体心脏灌流系统（上海继德）。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 一般情况 麻醉前称量每只大鼠体质量，麻醉约10 min 后大鼠心率/血压平稳，记录此时大鼠各项血流动力学指标数值（血流动力学基础值），注射BPV前采集动脉血样0.3 mL进行血气分析。记录各组大鼠发生心脏骤停所需时间。

1.3.2 心肌细胞线粒体提取 取大鼠心肌组织置于预冷的匀浆介质（160 mmol/L KCI，10 mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白，pH7.4）中迅速剪碎，组织匀浆机制成10%的匀浆，4 ℃条件离心半径10 cm，2000 r/min离心10 min，取上清液于4 ℃，离心半径10 cm，8500 r/min离心10 min；沉淀用重悬液（320 mmol/L 蔗糖，l0 mmol/L，Tris-HCI，pH 7.4）重悬后，于4 ℃，离心半径10 cm，8500 r/min离心10 min，沉淀物即为心肌细胞线粒体。

1.3.3 ATP 含量检测 于-80 ℃冰箱中取出心肌组织，称取100 mg 组织，用眼科剪剪碎后放入2 mL 离心管中裂解，4 ℃下离心半径10 cm，12000 r/min离心5 min取上清，按照磷钼酸比色法ATP试剂盒说明书操作。

1.3.4 ROS 水平检测 应用DHE 染色法将大鼠离体心脏于Langendorff 灌流装置系统缺血前平衡20 min，将心肌组织剪成小块，置于组织包埋块中，液氮冷冻后切成厚度为10 μm的心肌切片，于37 ℃条件下，在1.6 μm/L DHE的PBS中避光孵育30 min，置于激光共聚焦显微镜（激发波长480～535 nm，放射波长590～610 nm）下拍照观察。运用Image pro-Plus 6.0 采集其IOD 值和荧光面积，计算MOD值代表的ROS浓度。

1.3.5 细胞内Ca2+水平检测 将分离的心肌细胞从KB液中换到有钙Tyrode液中稳定1 h，离心半径10 cm，500 r/min 离心2 min 弃上清液，37 ℃避光条件下用Fluo-3/AM（终浓度为5 μmol/L）负载1 h 后，离心半径10 cm，500 r/min 离心1 min去除负载液，用有钙Tyrode液洗涤细胞2次，除去残余负载液。将DHE 负载的大鼠心室肌细胞培养皿置于ACAS 570载物台上，常温下测定所选细胞内钙值，置于激光共聚焦显微镜下（激发波长488 nm，发射波长526 nm，采样频率为488 Hz），连续动态扫描细胞内荧光强度变化，以平均荧光强度变化反映游离Ca2+水平。运用Image pro-Plus 6.0 采集其IOD 值和荧光面积，并计算MOD 值代表的Ca2+浓度。

1.3.6 MPTP活性测定 线粒体以肿胀液（120 mmol/L KCI，20 mmol/L M0pS，10 mmol/L Tris-Hcl，5 mmol/L KH2PO4，pH 7.4）稀释至0.25 g/L蛋白质，于25 ℃，200 μmol/L 的CaC12作用于线粒体，在540 nm 波长下连续观察线粒体吸光度（A540）变化15 min，30个循环。该吸光度变化可反映线粒体肿胀程度、MPTP的开放情况。

1.4 统计学方法采用SPSS 26.0 软件分析数据，计量资料以xˉ±s 表示，采用单因素方差分析，方差齐时组间多重比较采用LSD-t检验，方差不齐时，组间多重比较采用Tamhae's T2法，P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况与A 组相比，其余各组大鼠体质量、PO2、PCO2、pH、HR、MAP 差异均无统计学意义（P＞0.05）。E 组内关穴电针刺激后大鼠发生心脏骤停时间延长（P＜0.05）。见表1—2。

表1 各组大鼠血流动力学基础值（xˉ±s）

表2 各组大鼠发生心脏骤停时间比较（xˉ±s）

2.2 大鼠心肌组织线粒体浓度与ATP含量与A组相比，B组大鼠ATP含量与心肌组织线粒体浓度降低（P＜0.05）；与B 组相比，E 组ATP 含量与心肌组织线粒体浓度升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织线粒体浓度与ATP含量（xˉ±s）

2.3 大鼠心肌ROS 相对含量与A 组相比，B 组心肌ROS 相对含量升高（P＜0.05）；与B 组相比，E组ROS相对含量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠心肌ROS相对含量（xˉ±s）

2.4 大鼠心肌线粒体Ca2+浓度与MPTP与A组相比，B组心肌线粒体Ca2+荧光强度及MPTP开放程度降低（P＜0.05）；与B组相比，E组心肌线粒体Ca2+荧光强度及MPTP开放程度升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠心肌线粒体Ca2+浓度与MPTP比较（xˉ±s）

3 讨论

本研究结果显示，BPV 可降低心肌组织线粒体浓度，减少ATP合成及ROS蓄积，使线粒体肿胀，导致线粒体结构及功能发生改变，产生心肌毒性。而电针内关穴可有效延长大鼠发生心脏骤停的时间，提高线粒体浓度、ATP 含量，降低ROS，改善心肌损伤。

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，氧化磷酸化和电子传递发生障碍，导致ATP 合成减少，膜电位降低，损伤线粒体结构和功能［5］。布比卡因可通过抑制心室肌细胞内Ca2+内流［6］，抑制Ca2+ATP 酶活性，加剧线粒体内Ca2+降低［7］，抑制蛋白酶及钙依赖性磷脂酶活性，破坏生物膜结构，使心肌收缩抑制、线粒体超微结构破坏及功能障碍［8-9］。线粒体是ROS的主要来源场所，释放的ROS可触发邻近线粒体进一步释放ROS 形成恶性循环，ROS 异常增加会导致线粒体通透性改变，MPTP开放异常［10］。MPTP 是由线粒体内膜构成的钙离子依赖性非特异性通道，Ca2+超载使MPTP 过度开放，线粒体膜去极化与氧化磷酸化，致ATP 缺失，最终引起细胞凋亡［11］。本研究结果显示，BPV 中毒使线粒体内Ca2+浓度降低，MPTP 关闭，大量ROS蓄积；电针内关穴可有效提高线粒体内Ca2+浓度，使MPTP 开放，使多种离子和蛋白分子自由进出线粒体，维持线粒体结构，改善线粒体功能，抑制ROS过度释放，缓解线粒体损伤，保护心肌细胞。

内关穴是手厥阴心包经之络穴，属八脉交会穴之一，善治心胸诸疾［12］。在电针不同穴位对心肌缺血的治疗中，“内关穴”具有特异性效应［13］。电针大鼠“内关穴”能够有效缓解急性心肌缺血对心肌组织及线粒体结构的损伤［14］。电针内关穴可改善线粒体呼吸功能、抑制炎性反应、抑制钙超载及细胞凋亡［15-16］，从而发挥心肌缺血再灌注免受损伤的作用；经皮穴位电刺激内关穴用于全身麻醉胸腔镜手术，可减轻机体应激反应，减少阿片类药物用量，促进术后康复［17］。

综上所述，电针内关穴能有效改善BPV 对线粒体功能的抑制作用，通过调节心肌线粒体Ca2+浓度使MPTP 开放，从而发挥对BPV 心肌损伤的保护作用。