基于外泌体的多细胞信号网络和药物载体在调控脑缺血再灌注损伤中的研究进展*

周 宇，马 勇，李 斌，柴尔青△

（1兰州大学第一临床医学院 ，甘肃 兰州 730000；2甘肃省人民医院脑血管病中心，甘肃省脑血管病重点实验室，甘肃 兰州 730000）

脑卒中是全球第二大死因，在多种疾病中卒中的致死率与致残率总和占据第三位，其中主要以缺血性脑卒中为主，占全部卒中事件的62.4%，而在我国脑卒中是第一大致死性疾病和致残性疾病，同时患病率和死亡率在继续增加［1-2］。近年来，我国各级医院的卒中管理机制在不断完善，溶栓、颅内动脉取栓术、颈动脉支架植入术等再灌注策略更多地应用于脑卒中患者，大幅度地改善了患者的住院期间生存率、降低了年龄标准化死亡率，然而接受再灌注治疗患者的远期预后和生存质量仍较差，造成上述结果的原因除了社会老龄化导致的患者平均年龄升高外，由再灌注策略引发的脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）也发挥着重要作用［3-4］。

再灌注策略是当前治疗缺血性脑卒中的首选方案，然而也具有一定的风险，甚至在一些情况下会给患者带来更大的损伤［5-6］。其损伤机制主要与再灌注后的NADPH 氧化酶系统活跃、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、黏附因子表达增加以及大量细胞炎性因子释放有关［7-8］。再灌注条件下，神经元细胞中ROS的富集会导致能量代谢细胞器——线粒体的稳态（线粒体分裂和融合）被破坏，线粒体维持神经元钙调节和细胞膜电位受损，因而导致神经功能障碍［9］。此外，炎性因子的大量释放能够使外周的白细胞活化并迁移至脑组织，也导致进一步的脑损伤、血脑屏障破坏和血管源性水肿［10］。虽然当前在全球范围内对于CIRI 的研究日益重视，然而临床中仍然缺乏有效的抗CIRI 策略，因此仍需从更多的研究角度对CIRI 的发病机制和治疗方案进行探索［11-12］。

外泌体（exosome）是一种直径在50～150 纳米间的细胞外囊泡，其来源于内体，通过神经酰胺和/或转运所需的内体分类复合体依赖性途径衍生，经过多囊泡体融合后，几乎所有类型的细胞以胞吐的方式将外泌体分泌至各种体液中（血液、脑脊液、唾液等）［13-15］。随后外泌体通过与细胞膜融合、内吞、配体-受体相互作用等多种途径被受体细胞内化，将其包含的“货物”（蛋白、核酸、代谢物等）暴露于受体细胞胞质从而发挥细胞间信息传递因子的作用［16-17］（外泌体示意图见图1）。近年来的研究表明，外泌体作为同一组织不同细胞甚至不同组织细胞之间的信息传递桥梁参与了多种器官损伤的调节过程［18-20］。同时根据已有研究，来源于不同细胞的外泌体在具有共同外泌体特征的同时也存在着一些差异特征（表1）。而外泌体能够穿过血脑屏障的特性，也使得其有望成为了改善神经系统疾病的重要药物载体［21-22］。本文将围绕多细胞基于外泌体对CIRI 的调控以及外泌体作为药物载体治疗CIRI的研究进展进行综述，以图为改善CIRI 的深入研究提供一定的借鉴。

Figure 1. Schematic representation of exosome release. The multivesicular bodies in the donor cells fuse with the cell membrane to release exosomes through exocytosis，and then，the exosomes are captured by the recipient cells via endocytosis and release signal proteins and RNA in the cytoplasm.图1 外泌体释放示意图

表1 来源于不同细胞外泌体的特点Table 1. Characteristics of exosomes derived from different cells

1 多细胞的外泌体信号对CIRI的调控

1.1 内皮细胞的外泌体信号对CIRI 调控 内皮细胞作为血管的最内层细胞群体不仅是血管功能的调控单元之一直接参与循环系统调节，同时作为形成血脑屏障的主要细胞也首先对缺血再灌注影响做出响应，因此内皮细胞衍生的外泌体也参与了CIRI 的调控［28-30］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类位于基因组非编码区、长度约为22 个核苷酸的单链RNA 分子，其能够被外泌体携带并进入细胞，通过与目标蛋白的转录本结合从而抑制其表达，发挥调控多种生物过程的作用［31］。而内皮细胞通过分泌含有miRNA 的外泌体参与了对CIRI 的调控。Gao等［32］的研究发现，在缺氧/复氧条件下脑血管内皮细胞的外泌体中miR-126-3p 的表达量显著降低，并且接受正常条件培养的内皮细胞外泌体（EC-Exo）颅内注射的CIRI模型大鼠运动神经功能受损程度被显著改善，进一步的离体中通过糖氧剥夺/复氧（OGD/R）的PC12 神经细胞模型模拟缺血再灌注状态并给予EC-Exo 干预，结果显示内皮细胞可通过EC-Exo 将miR-126-3p 递送给神经细胞，能够降低OGD/R 条件下神经细胞的凋亡率、改善突触可塑性（提高突触长度、促进可塑性蛋白表达等），从而发挥改善神经细胞的再灌注损伤。此外，Yue 等［33］的研究表明，miR-1290 在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）衍生的外泌体（HUVEC-Exo）中显著富集，而通过对OGD/R 诱导的神经元细胞使用miR-1290 模拟物预处理显著抑制神经元细胞的凋亡和损伤，值得注意的是在OGD/R条件下神经元细胞自身也通过高表达内吞途径相关分子Caveolin-1 从而促进了神经元细胞对外泌体的内化过程，这体现了损伤状态下神经元细胞也通过自我调节促进对外界损伤调控信号因子的应答机制。同时脑血管内皮细胞也能够通过释放外泌体对再灌注诱导的内皮细胞自身损伤产生调节作用。Mohamud Yusuf等［34］通过抑制剂（阿米替林）抑制、小干扰RNA沉默等方法抑制人脑微血管内皮细胞（hCMEC）中酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）的表达，发现能够显著改善脑中动脉栓塞术（MCAO）后再灌注诱导的血脑屏障损伤、组织炎性浸润和神经元死亡，进一步的研究表明ASM 的抑制能够促进hCMEC以外泌体的形式释放因再灌注诱使累积的细胞内囊泡，而这些外泌体富含与吞噬作用、蛋白质输出等功能相关蛋白从而促进hCMEC 的管形成、迁移、和血管内皮细胞生长因子分泌能力，从而发挥改善脑血管和脑组织的缺血再灌注损伤。因此，缺血再灌注状态下应当重视缺血区域血管内皮功能的改善，从而促进CIRI的恢复。

1.2 神经胶质细胞的外泌体信号对CIRI 调控 神经胶质细胞包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，三者均参与了缺血性脑病的诸多病理生理过程［12］。当前对于胶质细胞的外泌体信号调控CIRI 的研究主要集中于小胶质细胞，小胶质细胞是中枢神经系统中主要的天然免疫细胞，其可因多种疾病状态的诱导由静息状态向激活状态改变，且激活的小胶质细胞又因不同的特征和功能被分类为M1 样（促炎性和神经毒性）和M2 样（抑炎性）两种表型［35］。二者分别通过多种信号途径参与了神经炎性损伤的发生和修复过程，因此两种表型之间的平衡也决定了神经功能损伤的方向［36-37］。Li 等［37］使用白介素4（IL4）成功诱导获得M2小胶质细胞，随后提取其外泌体（M2-Exo）并通过体内注射干预MCAO 术后再灌注的小鼠，结果显示与PBS 和未处理的小胶质细胞来源外泌体（M0-Exo）相比，体内注射M2-Exo 能够减少MCAO 后再灌注导致的脑萎缩、改善感觉运动和认知功能、并促进小鼠脑白质在再灌注28 d 后的结构重塑和功能修复，进一步转录组学和荧光素酶报告基因实验表明M2-Exo 携带的miR-23a-5p 通过直接靶向少突胶质细胞转录因子3 从而促进少突胶质细胞的生成，因而发挥改善再灌注诱导的脑萎缩并促进白质重塑［。同时M2 小胶质细胞来源的外泌体信号能够保护神经元细胞免于再灌注损伤诱导的细胞凋亡。研究显示M2-Exo 能够抑制OGD/R 诱导的神经元细胞凋亡增加和神经源性位点Notch 同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）的高表达，而在使用miR-137 的抑制剂后这种效应显著减弱，进一步的荧光素酶报告基因实验表明Notch1 是miR-137 的直接靶标，既往研究已经表明Notch 信号通路在多种生理系统的缺血损伤机制中发挥关键作用，因此可知M2小胶质细胞能够通过释放携带miR-137的M2-Exo直接抑制神经元细胞Notch1 的表达从而发挥改善神经元细胞的再灌注损伤作用［38-39］。此外Song 等［40］的研究表明，当M2 小胶质细胞的miR-124 被慢病毒敲低时，M2-Exo 中的miR-124 水平也显著降低，此时M2-Exo 改善大鼠在MCAO 再灌注下的脑梗死面积和神经元细胞在OGD/R 条件下细胞凋亡的能力被显著抑制，然而当加入泛素特异性肽酶14（ubiquitin-specific protease 14，USP14）的抑制剂时，大鼠脑梗死面积和神经元细胞的损伤再次被减弱，随后的荧光素酶报告基因实验也证明USP14是miR-124 的直接靶点，因此M2-Exo 中的miR-124 通过直接靶向神经元细胞的USP14改善了神经元细胞的再灌注损伤。由上述可见，小胶质细胞通过外泌体对脑再灌注损伤的调控具有多信号因子、多靶点、多效应的特点，这值得进一步的研究，以构建一个复合的外泌体干预再灌注损伤策略。此外既往研究表明：与神经元相比星状胶质细胞具有更强的抗缺血能力，星形胶质细胞的存活具有恢复神经元完整性和促进功能改善的潜力（特别是在缺血半暗带）［41］。有研究报道，侧脑室接受星状胶质细胞外泌体注射的MCAO/R 模型大鼠的脑梗死面积显著减小，且随着干预时间的推移，与正常星状胶质细胞外泌体干预相比，接受缺氧预处理的星状胶质细胞外泌体注射的大鼠表现出更显著的大脑结构和神经功能恢复、更快地清除的脑细胞水肿和坏死，并修复轴突损伤［42］。可见，星形胶质细胞对缺血状态的应激信号能够发挥保护神经元的作用。

1.3 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的外泌体信号对CIRI 的调控 MSCs 是多种不同的多功能干细胞的统称，其能够从包括脂肪、脐带和骨髓等在内的多种组织中分离出，已有的研究表明MSCs 除了能够向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等分化外还通过直接相互作用和旁分泌（直接分泌、细胞外大囊泡、外泌体等）等形式参与了免疫调节和再生等生理过程，而当前MSCs的外泌体信号对器官损伤的调控成为了重要的再灌注研究靶点［43-45］。在Li等［46］的研究中，研究人员通过体内注射骨髓MSCs来源的外泌体（BMSC-Exo）能够显著缓解MCAO 术后再灌注诱导大鼠的神经元细胞凋亡、神经功能损伤、以及组织炎性因子的富集，进一步研究发现BMSCExo将携带的miR-150-5p输送至神经元细胞中，miR-150-5p 能够与Toll 样受体5 基因（TLR5）的转录本结合，抑制缺血再灌注条件下由TLR5蛋白上调诱导的神经元细胞凋亡和炎性因子释放从而发挥改善再灌注损伤的作用。不仅是骨髓MSCs，脂肪MSCs（ASC）来源的外泌体（ASC-Exo）也能够减轻OGD/R 诱导的神经元细胞损伤。ASC-Exo 中携带的miR-22-3p 能够靶向神经元细胞的赖氨酸特异性脱甲基酶6B（KDM6B）基因，KDM6B 蛋白与骨形态发生蛋白2（BMP2）的启动子区域结合并耗竭组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰（H3K27me3）进而激活BMP2/BMF（Bcl2 蛋白修饰因子）信号通路发挥促细胞凋亡的作用，因此ASC-Exo 通过miR-22-3p 抑制了神经元细胞的KDM6B/BMP2/BMF 信号通路发挥改善神经元再灌注损伤的作用［47-48］。此外，MSCs 来源外泌体可能会通过引起多细胞的连锁反应发挥抗再灌注损伤的作用。Hu 等［49］发现，人脐带来源的MSCs（UMSC）的外泌体（UMSC-Exo）能够显著改善OGD/R诱导的小胶质细胞活力降低，抑制细胞焦亡的表达，并上调线粒体自噬相关蛋白的表达，表明UMSC-Exo能够抑制小胶质细胞因OGD/R诱导的的焦亡并促进线粒体自噬过程，此外OGD/R 条件下小胶质细胞的无细胞培养基（OGD/R-CM）能够诱导SH-SY5Y 神经细胞的凋亡和细胞损伤，而UMSC-Exo 干预小胶质细胞后，这种神经损伤能力被抑制，进一步的机制研究表明UMSC-Exo 通过促进小胶质细胞叉头框蛋白O3依赖性线粒体自噬过程从而抑制其在再灌注条件下的细胞焦亡，继而保护因小胶质细胞再灌注损伤诱导的神经细胞损伤。

上述研究表明，多细胞间的信息网络参与了再灌注条件下的微环境病理和修复过程（图2）。

Figure 2. Regulation of exosome signals in cerebral ischaemia reperfusion injury. A： endothelial cells secrete exosomes containing miR-126-3p and miR-1290 to protect neurons and secrete exosomes containing angiogenic factors to promote microvascular formation； B： astrocytes secrete exosomes to protect neurons； C： resting microglia are activated into M2 microglia and secrete exosomes containing miR-137 and miR-124 to protect neurons and secrete exosomes containing miR-23-5p to protect oligodendrocytes； D： bone mesenchymal stem cells secrete exosomes containing miR-150-5p to protect neurons； E： adipose-derived mesenchymal stem cells secrete exosomes containing miR-22-3p to protect neurons； F： umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit neuronal pyroptosis and promote mitochondrial autophagy to protect neurons through exosomes.图2 外泌体信号在脑缺血再灌注损伤中的调控

2 作为药物载体的外泌体在CIRI中的应用

2.1 外泌体作为基因药物载体在CIRI 中的应用基因治疗作为一种治疗手段已经被研究多年，其除了具有高特异性的特点外，并且一些基因药物因基因的持续表达而具有更久的治疗效果［50］。此外通过施加小干扰RNA 靶向沉默组织细胞中的某些蛋白的基因表达也是基因治疗的一种方法［51］。外泌体因其具有生物兼容性、无毒、可透过血脑屏障等特点成为了基因药物的有效载体。晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end product receptor，RAGE）是I/R 损伤的病理生理学关键因素之一，病理状态下损伤分子与RAGE 的结合激活RAGE 介导的信号通路能够引发一系列的严重炎症反应导致组织损伤［52］。RAGE 拮抗肽（RAGE-binding peptide，RBP）能够抑制RAGE 的表达减轻I/R 损伤，Kim 等［58］使用重组DNA 技术将RBP 的cDNA 插入外泌体膜蛋白Lamp 2b 表达质粒的5'末端，获得了外部连接有RBP的外泌体（RBP-Exo），并用其装载抗miR-181a 的寡核苷酸（AMO181a，能够与miR-181a 结合抑制其功能，装载剂量与外泌体重量比为1∶5），将该药物载体外泌体（RBP-Exo-AMO181a）通过鼻内给药干预MACO再灌注大鼠模型，结果表明RBP-Exo-AMO181a的干预能够减少脑梗死面积并抑制神经细胞的凋亡，机制研究显示RBP-Exo-AMO181a 中的AMO181a 通过与mi-181a 结合减弱了mi-181a 对凋亡抑制蛋白Bcl-2 的敲低能力，从而改善了再灌注下脑细胞凋亡诱导的脑损伤。Zhao等［54］通过使用慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞获得了富含miR-223-3p的外泌体（Exo-miR-223-3p）并用于干预MCAO/R 模型大鼠，Exo-miR-223-3p 显著减少了再灌注损伤大鼠的脑梗死面积、改善了神经功能损伤程度，细胞研究揭示其机制：miR-223-3p 能够靶向半胱氨酰白三烯受体2（CysLT2R），抑制由半胱氨酰白三烯（CysLTs）诱导的小胶质细胞向炎性表型M1 转化并促进小胶质细胞向抗炎表型M2转化，因此抑制了大脑微环境的炎症反应进展进而改善再灌注损伤。上述研究均证明了基因载体外泌体作为抗CIRI治疗的潜在价值。

2.2 外泌体作为天然药物载体在CIRI 中的应用天然化合物是全球范围内难治性疾病治疗的研究热点，目前已经有天然化合物作为缺血性血管疾病的治疗药物被应用于临床［55-56］。已有研究通过体外培养基中加入高剂量（3 μg/mL）的姜黄素（curcumin，Cur）连续抚育巨噬细胞成功获得加载Cur 的巨噬细胞源外泌体（Cur-Exo），由于外泌体的包裹显著降低了Cur 的血清降解效率并提高了其在脑组织中的积累，用于体内干预后发现该外泌体继承了巨噬细胞趋炎症特性能够在再灌注条件下的脑组织损伤区域中富集（与神经炎症有关），药理研究结果显示在MACO/R 大鼠模型中Cur-Exo 能够抑制ROS 诱导的神经元细胞线粒体损伤、降低神经细胞的凋亡率、保护血脑屏障的完整性、降低脑梗死面积，从而改善再灌注诱导的神经功能损伤［57］。表明通过构建携带天然化合物的外泌体作为药物能够提高天然化合物的稳定性和溶解性，此外通过修饰外泌体的膜蛋白还可实现针对特定器官的靶向用药［58］。Guo 等［59］梯度分离法获得大鼠血清外泌体并与槲皮素（quercetin，Que）在超声震荡下赋予构建了加载Que 的外泌体（Que-Exo），此过程使Que 的溶解度从游离状态的30.15 mg/L 提升至86 mg/L，并碳二亚胺法将生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）的单克隆抗体（mAb GAP43）偶联在Que-Exo 表面获得表面修饰的载药外泌体（Que/mAb GAP43-Exo），GAP43是一种神经元特异性蛋白且在缺血再灌注损伤条件下过表达，因此偶联mAb GAP43 的外泌体能够靶向作用于受损的神经元，进一步的体内和体外实验显示Que/mAb GAP43-Exo 能够通过上调神经元核因子E2 相关因子2/血红素加氧酶1 信号通路从而抑制再灌注条件下ROS诱导的神经元细胞损伤。这些研究为构建具有精准靶向特性且能够稳定存在于生物体内环境的天然药物载体外泌体奠定了基础。

3 总结

脑缺血再灌注损伤是当前溶栓或介入治疗广泛应用于缺血性脑疾病背景下的另一个临床难题。其主要涉及了神经炎症、氧化应激、细胞自噬等多种病理过程诱导的神经元损伤，同时也受到了来自脑血管内皮细胞、胶质细胞、巨噬细胞、间充质细胞等多种细胞的调控，其中由多细胞的外泌体构建的信号网络在其中发挥着重要作用，因此对于通过调控外泌体信号改善CIRI 成为了CIRI 治疗的关键研究焦点。此外，因其独特的生物学特性和功能使得外泌体也成为了促进药物靶向作用于损伤器官的有效载体，且在研究领域已经取得了一定的进展。然而，基于外泌体信号以及药物载体的抗CIRI研究仍然处于实验阶段，同时药物载体外泌体的制备工序复杂并且负载药物占比有限从而限制了其在CIRI领域的广泛研究，因此仍需进一步完善外泌体和药物载体外泌体的获取工序、探索并开发出能够应用于临床的外泌体信号调控药物或药物载体外泌体，以达到改善和治疗CIRI的目的。