硫化氢对糖尿病大鼠皮肤创面自噬和血管形成的影响*

李媛媛，赵富生，张可心，陈永兰，张 娜，姜昕悦，谷春付，武 庚

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种常见多发的慢性代谢性疾病，据糖尿病联合会发布的报告显示，2021 年全球20～79 岁人群DM 患病率为10.5%，到2045 年将上升至12.2%［1］。糖尿病皮肤溃疡（diabetic cutaneous ulcer，DCU）是DM 患者常见的并发症之一，致残率高且治疗昂贵，严重影响DM 患者的生活质量。目前，DCU 治疗方法主要包括控制血糖、抗感染和清创治疗等，但效果并不理想，因此迫切需要探索新的治疗策略［2］。DM 皮肤创面难以愈合的病理机制主要包括创面局部生长因子分泌减少、氧化应激、血管受损、慢性炎症反应等［3］。研究表明，在创伤愈合过程中，适度自噬具有维持局部组织内环境稳定，减轻氧化应激和炎症反应，促进血管生成和组织重建等作用［4］。DM 创伤后产生的大量活性氧可导致创面组织自噬失调，加剧局部组织炎症反应，进而影响创面愈合［5］。因此，调节DM 创面组织的自噬活性，可能是一种有效的治疗策略。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。机体内H2S 主要由胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）、胱硫醚β-合成酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶三种酶催化合成［6］。H2S 具有抗炎症、抗凋亡、抗氧化应激、调控自噬以及舒张血管等多种生理功能［7-9］。然而，H2S 是否可以调控自噬，促进DM 皮肤创面血管形成和愈合，目前尚不清楚。本研究通过建立DM大鼠皮肤损伤模型，观察H2S 对DM 大鼠皮肤创面愈合的影响，并探究其可能机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠36 只，8 周龄，体质量（250±10） g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号为SCXK（辽）2020-0001。大鼠饲养于牡丹江医学院实验动物中心，环境温度22～24 ℃，通风良好。实验过程符合国家及单位实验动物管理和使用规定。

1.2 主要试剂及仪器 链脲佐菌素（streptozocin，STZ；北京索莱宝科技有限公司）；H2S 荧光探针C-7Az（7-azido-4-methylcoumarin）、硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS； Sigma-Aldrich）；CSE、CD31、微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、caspase-3、Bcl-2 和Bax 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；beclin-1、P62、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 抗体，碘化丙啶（propidium iodide，PI），以及TUNEL染色液（碧云天生物技术有限公司）。激光共聚焦显微镜（LSM700，Zeiss）。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠皮肤创伤模型的建立及分组 DM大鼠模型制备前禁食18 h（不禁水），腹腔注射1% STZ（50 mg/kg）诱导DM，72 h 后尾静脉采血检测大鼠血糖，血糖≥16.67 mmol/L表示DM模型制备成功。饲养三周后，制备皮肤创伤模型［10］。具体操作如下：大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（30 mg/kg），清除大鼠背部毛发，常规消毒，剪切直径为2 cm 全层皮肤，深至筋膜。将DM 皮肤创伤大鼠随机分为DM 组和DM+NaHS 组，未注射STZ 大鼠为正常对照（control）组，每组12只。DM+NaHS组大鼠于创面建立当日腹腔注射NaHS（56 μmol/kg），每天1 次，连续注射21 d［11］。DM组和control组大鼠每日腹腔注射等体积生理盐水。

2.2 标本采集 创面建立第21 天，每组随机选取6只大鼠乙醚麻醉断颈处死，取创面皮肤组织，一半制备石蜡切片用于HE染色，另一半制备冰冻切片行免疫荧光染色；各组剩余6 只大鼠，取创面组织于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot 分析。实验动物处理流程见图1。

2.3 创面愈合率分析 手术第0、7、14、21 天采集创面图像，用ImageJ 软件分析创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

2.4 创面组织H2S含量检测 取冰冻切片，复温、固定后，加C-7Az 工作液（1∶100），激光共聚焦显微镜采集图像，用ImageJ 软件分析荧光强度。取皮肤创面组织裂解、匀浆、离心，BCA 法测定蛋白浓度。SDS-PAGE 分离蛋白，转膜、封闭后，加入CSE 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，次日加入相应Ⅱ抗，37 ℃孵育2 h，加ECL 发光试剂，置成像仪中成像。采用ImageJ软件分析目的蛋白条带相对灰度值。

2.5 HE 染色 取石蜡切片（5 μm），二甲苯脱蜡、水化、苏木精-伊红染色，常规脱水、中性树脂封片，光镜下观察组织形态结构及血管分布，通过ImageJ 软件分析创面愈合情况。

2.6 创面组织血管生成检测 （1）取冰冻切片固定、封闭，加CD31 抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜，次日加Cy3标记的Ⅱ抗，DAPI染色细胞核，激光共聚焦显微镜采集图像，ImageJ 软件分析CD31 荧光强度。（2）蛋白分离、转膜后，加CD31 抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，次日加相应Ⅱ抗，显影成像，用ImageJ软件分析CD31条带相对灰度值。

2.7 创面组织血管内皮细胞自噬检测 （1）取冰冻切片，加入CD31和beclin-1抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日加FITC 和Cy3 标记的Ⅱ抗，DAPI 染细胞核。采用ImageJ 软件分析CD31+/beclin-1+细胞数。（2）蛋白分离、转膜后，加入LC3抗体（1∶500）、P62抗体（1∶1 000）、beclin-1 抗体（1∶1 000）和β-actin 抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，次日加入相应Ⅱ抗，显影成像。用ImageJ软件分析目的蛋白条带相对灰度值。

2.8 创面组织血管内皮细胞凋亡检测 （1）取冰冻切片固定，加入CD31 抗体（1∶200）、TUNEL 染色液、caspase-3 抗体（1∶200）和PI 染色液（50 mg/L），4 ℃孵育过夜，次日加入相应Ⅱ抗，DAPI 染细胞核。激光共聚焦显微镜采集图像，用ImageJ 软件分析CD31+/TUNEL+细胞数。（2）蛋白分离、转膜后，加入Bcl-2 抗体（1∶1 000）、Bax 抗体（1∶1 000）和β-actin 抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，次日加入相应Ⅱ抗，37 ℃孵育2 h，显影成像，ImageJ软件分析目的蛋白相对灰度值。

2.9 创面组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达检测蛋白分离、转膜后，加入Ⅰ抗（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 和p-mTOR 抗体，1∶1 000；β-actin抗体，1∶2 000），4 ℃孵育过夜，显影成像，ImageJ 软件分析目的蛋白相对灰度值。

3 统计学处理

应用SPSS 18.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，创面愈合实验采用多因素方差分析重复测量。其余实验采用单因素方差分析，方差齐用LSD 法，方差不齐用Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NaHS对皮肤创面愈合的影响

手术第0、7、14、21 天，各组大鼠创面愈合情况如图2 所示。DM+NaHS 组创面愈合率在术后第7、14、21 天显著高于DM 组（P＜0.05），但低于control 组愈合水平（P＜0.05）。

Figure 2. The skin wound healing of rats at different time points in each group. Mean±SD. n=12. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DM group.图2 不同时间点各组大鼠皮肤创面愈合情况

2 NaHS对皮肤创面组织H2S含量的影响

C-7Az 荧光染色及分析如图3A～3B 所示，与control 组相比，DM 组C-7Az 荧光强度显著降低（P＜0.01）；与DM 组相比，DM+NaHS 组C-7Az 荧光强度显著升高（P＜0.01），但未恢复到control 组水平（P＜0.01）。CSE 蛋白表达如图3C 所示，与control 组相比，DM 组CSE 表达水平显著降低（P＜0.01）；与DM组相比，DM+NaHS 组CSE 表达显著升高（P＜0.01），但仍低于control组水平（P＜0.01）。

3 NaHS对皮肤创面组织形态学的影响

HE 染色如图4A 所示，control 组创面修复良好，可见肉痂、毛囊及较多毛细血管；DM 组创面表层薄，陈旧性肉芽组织多，毛细血管少；DM+NaHS 组创面表层较厚，可见新生肉芽组织、大量纤维成分及毛细血管。创面宽度分析如图4B 所示，与DM 组相比，DM+NaHS 组表皮层创面宽度显著减小（P＜0.01），但仍宽于control组水平（P＜0.01）。

4 NaHS对皮肤创面组织血管生成的影响

如图5A 所示，control 组血管数量多，分布均匀；DM 组血管管径细且数量少，分布杂乱；DM+NaHS 组血管数量较多。CD31 免疫荧光染色结果显示，与control 组相比，DM 组CD31 荧光强度显著降低（P＜0.01）；DM+NaHS 组CD31 荧光强度较DM 组显著增加（P＜0.01），但仍低于control 组（P＜0.01），见图5B、C。Western blot 结果显示，与control 组相比，DM 组CD31 表达水平显著降低（P＜0.01）；DM+NaHS 组CD31 表达水平较DM 组显著升高（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.05），见图5D。

Figure 5. Angiogenesis of skin wound tissues of rats in each group. A： representative HE stained images of rat skin wound tissues in each group （scale bar=100 μm）； B： representative immunofluorescence staining images of CD31 in skin wound tissues of each group （red represents CD31，while blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）； C： fluorescence intensity comparison of CD31 in rat skin wound tissues of each group； D： comparison of relative expression of CD31 in rat skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs cntrol group； ##P＜0.01 vs DM group.图5 各组大鼠皮肤创面组织血管生成比较

5 NaHS对皮肤创面组织血管内皮细胞自噬的影响

血管内皮细胞自噬检测如图6A、6B 所示，与control 组相比，DM 组CD31+/beclin-1+阳性细胞增多（P＜0.01）；经NaHS 干预后，DM+NaHS 组CD31+/beclin-1+阳性细胞显著减少（P＜0.01），但仍多于control组（P＜0.01）。

Figure 6. Comparison of endothelial autophagy in rat skin wound tissues of each group. Representative immunofluorescence staining images of CD31 and beclin-1 in rat skin wound tissues of each group （red and green represent beclin-1 and CD31，respectively，while blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=100 μm） and comparison of the number of CD31+/beclin-1+ cells. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.图6 各组大鼠皮肤创面组织血管内皮细胞自噬比较

Western blot 结果如图7A～7D 所示，与control 组相比，DM 组P62 表达水平降低（P＜0.01），LC3-II/LC3-I和beclin-1表达显著升高（P＜0.01）；经NaHS干预后，DM+NaHS 组P62 表达升高（P＜0.01），LC3-II/LC3-I 和beclin-1 表达显著降低（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.05）。

Figure 7. Comparison of the expression of autophagy-related proteins in skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.图7 各组大鼠皮肤创面组织自噬相关蛋白表达比较

6 NaHS对皮肤创面组织血管内皮细胞凋亡的影响

血管内皮细胞凋亡检测如图8A、8B 所示，与Control 组相比，DM 组CD31+/TUNEL+阳性细胞增加（P＜0.01）；经NaHS 干预后，DM+NaHS 组CD31+/TUNEL+阳性细胞显著减少（P＜0.01），但仍高于control组水平（P＜0.01）。创面组织caspase-3 和PI 染色如图8C～8F 所示，与control 组相比，DM 组caspase-3 和PI 荧光强度增加（P＜0.01）；经NaHS 干预后，DM+NaHS 组caspase-3 和PI 荧光强度显著降低（P＜0.01），但仍高于Control组水平（P＜0.01）。

7 NaHS对皮肤创面组织凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot 结果如图9A、9B 所示，与control 组相比，DM 组创面组织Bcl-2 表达降低（P＜0.01），Bax表达升高（P＜0.01）；经NaHS 干预后，DM+NaHS 组Bcl-2表达升高（P＜0.01），Bax表达降低（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.05）。

8 NaHS对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达的影响

Western blot 结果如图10A～10D 所示，与control组相比，DM 组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值均显著降低（P＜0.01）；经NaHS 干预后，DM+NaHS 组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均显著升高（P＜0.01），但未恢复到control 组水平（P＜0.05）。

Figure 10. Comparison of the expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in rat skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.图10 各组大鼠皮肤创面组织PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的比较

讨 论

DM 患者长期高血糖状态会引起全身小动脉和终末微小血管硬化，造成组织缺血缺氧易诱发溃疡创面形成。由于氧化应激、慢性炎症、微小血管病变等原因，DM 患者皮肤创面难以治愈，严重会发生坏疽导致截肢甚至危及生命。目前，DM 患者皮肤溃疡尚无有效的治疗手段。一些新兴的治疗方法，如干细胞治疗、新型合成生物材料、生长因子疗法等均存在治疗成本高、免疫原性等局限性。因此，亟需探索安全、有效的治疗措施促进DM创面的愈合。

H2S 作为一种新型气体信号分子，在抗炎、抗氧化和抗凋亡多个方面发挥调节作用［12］。研究显示，H2S 能够抑制炎症反应和氧化应激，缓解1 型DM 小鼠的焦虑样行为［13］，减轻高血糖引起的动脉粥样硬化［14］。在哺乳动物，H2S主要由两种5'吡哆醛磷酸依赖酶，即CSE 和胱硫醚β-合成酶催化合成［15］。本研究结果显示，DM 大鼠皮肤创面组织H2S 含量和CSE蛋白水平均显著降低，提示DM创面延迟愈合可能与H2S 合成受损有关。基于H2S 参与调节机体多种病理生理过程，我们推测，NaHS能够增加DM 大鼠皮肤创伤组织H2S 含量，上调创面组织CSE 蛋白表达，改善或促进DM大鼠皮肤创面愈合。

自噬是一种依赖溶酶体的分解代谢过程，对维持机体内环境稳态起着重要作用［16］。LC3、P62和beclin-1 蛋白是自噬形成过程中的关键蛋白。当自噬激活时，胞浆中LC3-I 被转化为LC3-II，后者在溶酶体分解代谢转化为LC3-I。P62作为一种自噬特异性底物，与LC3 相互作用进入自噬体内，被溶酶体降解。P62蛋白降低的同时伴随LC3-II蛋白上调，提示自噬活性增加［17］。有研究报道，血管紧张素IV 通过抑制FoxO1 诱导的自噬，减轻DM 小鼠心肌损伤［18］。研究显示，自噬在DM 创面愈合的炎症期、增殖期和组织重建期发挥重要作用，自噬增强或抑制可导致细胞凋亡，不利于DM创伤的恢复［19］。本研究结果显示，DM 大鼠皮肤创面组织内皮细胞自噬活性显著增强，创面组织LC3-II/LC3-I 和beclin-1 表达增加，P62表达减少，提示DM大鼠皮肤创面组织内皮细胞自噬过度激活，给予外源性H2S能够抑制创面组织内皮细胞的自噬活性，促进DM大鼠创面组织血管形成和创面愈合。

自噬和凋亡为调控细胞生物学功能的两种基本分子机制，其信号分子通过各种关联和干扰，影响多种疾病的病理生理过程，如冠心病等［20］。索拉非尼可通过髓样细胞白血病1 激活beclin-1 诱导肝癌细胞自噬性死亡［21］。caspase-3 家族蛋白是细胞凋亡的重要效应因子，为细胞凋亡的执行蛋白，其激活预示着凋亡进入不可逆转阶段［22］。Bax 是机体中重要的凋亡基因之一，具有促进细胞凋亡的作用。Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，可维持线粒体膜的完整性，阻止促凋亡蛋白释放，发挥抗凋亡作用［23］。本研究结果显示，DM 大鼠皮肤创面组织内皮细胞凋亡数量显著增多，caspase-3 和Bax 表达增加，Bcl-2 表达减少，推测可能与自噬过度激活有关。然而，NaHS 能够减轻DM 大鼠创面组织血管内皮细胞自噬和凋亡，发挥抗凋亡作用，促进皮肤创面的愈合。

PI3K/Akt/mTOR 是调控细胞自噬的信号通路，参与细胞增殖、分化和凋亡过程。本研究结果显示，DM 大鼠皮肤创面组织PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白表达显著降低。由此推测，PI3K/Akt/mTOR 信号通路可能参与DM皮肤创面的愈合过程。研究表明，半胱氨酸通过激活Akt/PI3K/mTOR 通路减轻内质网应激和炎症反应，改善高糖诱导的人脂肪基质干细胞代谢异常［24］。此外，有研究报道胰高血糖素样肽1受体激动剂可激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路减轻高糖诱导的髓核细胞损伤［25］。本研究结果显示，NaHS干预能够上调DM 大鼠皮肤创面组织PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白表达，增加创面组织毛细血管密度，提高创面愈合率，促进DM大鼠皮肤创面愈合。由此推测，H2S 可能通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路，减轻创面组织血管内皮细胞自噬及凋亡，发挥促进DM创伤愈合的作用。

综上所述，H2S 能够促进DM 大鼠皮肤创面愈合，其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，抑制血管内皮细胞自噬及凋亡，促进创面组织血管形成有关。本研究为DCU治疗提供了新的实验依据，但实验结果均为体内研究，下一步将采用细胞模型进一步探讨H2S可能激活的信号通路及分子机制。