DJ-1通过保护线粒体复合体I活性介导白藜芦醇减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤*

任建民，刘慧茹，刘 松，李晓琪，何 康，汤 蕾，陈和平

（南昌大学药学院江西省基础药理学重点实验室，江西 南昌 330006）

缺血性心脏疾病对全球的公共健康构成重大威胁，临床管理的最佳策略是通过溶栓方法或经皮冠状动脉介入治疗恢复冠状动脉血流［1］。然而，当阻塞的冠状动脉重新开放时，缺血心肌会因血液供应的突然增加而进一步受损，这一过程被称为心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤［2］。心肌I/R 损伤机制涉及氧化应激损伤、凋亡、线粒体功能障碍等因素［3］。其中氧化应激是指正常氧化剂清除酶系统［如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽］和细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生之间的不平衡，会通过多种途径直接引起心肌细胞的凋亡、自噬、炎症等损伤［4］。已有研究表明，线粒体复合体I 是线粒体中ROS产生的主要场所，心肌I/R 期间ROS过量产生的主要原因与线粒体复合体I的氧化损伤有关［5-6］。DJ-1（又称帕金森病蛋白7，Parkinson disease protein 7，PARK7）作为一种多功能保护性蛋白，具有线粒体功能调节和促进细胞存活等功能［7-8］。此外，在正常生理状态下，DJ-1 定位在细胞质，而在应激条件下，DJ-1 会易位至线粒体［9-10］。值得注意的是，据报道，DJ-1与线粒体复合体I 的两个亚基ND1 （NADH dehydrogenase subunit 1）和NDUFA4 ［NADH dehydrogenase（ubiquinone） 1 alpha subcomplex 4］结合，有助于复合体I 的稳定性，而DJ-1敲除或突变导致线粒体复合体I 活性降低，增加对ROS 和线粒体复合物I 抑制剂的敏感性，DJ-1 表达的恢复缓解了这种现象［9，11］。上述研究表明，DJ-1蛋白在维持线粒体复合体I活性中发挥着关键作用。

白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种天然多酚类化合物，富含于花生、葡萄和浆果等食物中，因其抗炎和抗氧化特性而闻名，同时具有缓解心肌I/R 损伤的保护作用［12-13］，还可缓解糖尿病诱导的大鼠心功能障碍［14］。已有研究表明，DJ-1 介导RES 预处理而减轻缺氧复氧后H9c2 细胞损伤［15］；DJ-1 通过维持线粒体复合体I的活性参与H9c2 细胞缺氧预适应延迟保护作用［16］。但是DJ-1是否介导RES预处理对抗心肌I/R 所诱发的氧化应激损伤机制尚不完全清楚。因此，本研究拟在整体水平上探讨RES对心肌I/R 诱发的氧化应激损伤及DJ-1蛋白的影响，并明确其机制。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级健康雄性SD 大鼠均购自南昌大学动物实验中心，体重在220～240 g 之间，其中动物使用许可证号SYXK（赣）2023-0019。大鼠均在标准实验室中喂养，饲养条件为：空气湿度保持在（50±2）%，温度保持在（25±2） ℃，12 h 光/暗交替，并提供充足的食物及水。

2 主要试剂

RES 和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液购自北京索莱宝科技有限公司；线粒体复合体I 活性检测试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒和SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DJ-1 和ND-1 抗体购自Abcam；NDUFA4 抗体购自Proteintech；GAPDH 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；COX IV 抗体购自Sigma-Aldrich；羊抗兔IgG 多克隆抗体购自杭州华安生物技术有限公司；组织线粒体分离试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；MitoSOXTMRed 检测试剂盒购自Invitrogen；线粒体复合体I抑制剂IACS-010759购自TargetMol；sh-DJ-1和阴性对照（negative control，NC）慢病毒构建于上海吉凯基因科技有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠I/R 模型的构建及分组 通过腹腔注射

10%水合氯醛来麻醉SD 大鼠。参照文献［17］，麻醉完成后，将大鼠连接小动物专用呼吸机，通过用6-0 丝线活结结扎冠状动脉左前降支诱发心肌缺血。心肌缺血30 min 后，解开活结，开始2 h 的血流再灌注。大鼠随机分为6 组：sham 组（开胸后只穿线，不进行结扎）、I/R 组、RES+I/R 组、NC+RES+I/R 组、sh-DJ-1+RES+I/R 组和IACS-010759+RES+I/R 组。心肌I/R 前1 周大鼠接受RES（20 mg/kg）灌胃，每日一次。其中对IACS-010759+RES+I/R 组大鼠 在I/R 术前2 d 给予IACS-010759（10 mg/kg）灌胃。此外，sham 和I/R 组大鼠均通过灌胃接受等体积的生理盐水。

3.2 慢病毒心肌内注射 麻醉完成后，将SD 大鼠固定于手术台，用止血钳逐层钝性分离左侧胸大肌后，正确暴露左心室及心尖部位置，绕过血管于左心室的上部分取两点、左心室下部分取两点及心尖部取一点，用微量注射器分别注射滴度为5×108TU/L的sh-DJ-1 或NC 慢病毒50 μL，针尖于心肌水平面呈60°左右的角度进针，进针深度约2 mm，缓慢注射完毕后，用棉签立即止血。术后1 周内，经心肌内注射的大鼠均腹腔注射8×104U 的青霉素钠防止感染。1周后，NC+RES+I/R 和sh-DJ-1+RES+I/R 组大鼠均接受RES（20 mg/kg）灌胃7 d，每日一次。

3.3 Western blot 收集心脏组织裂解物，或用组织线粒体分离试剂盒分离线粒体和细胞质的蛋白质。通过SDS-PAGE 分离，并转移到PVDF 膜中，用5%脱脂乳密封2 h。在4 ℃下Ⅰ抗孵育过夜，将Ⅱ抗在室温下与膜孵育1 h，然后用ECL 发光液鉴定印迹，最后用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

3.4 免疫共沉淀法 蛋白提取完成后，将上清液离心分离，并进行蛋白定量后备用。取500 μg 蛋白样品，加入1 μL的DJ-1抗体，在4 ℃下缓慢摇动孵育过夜；加入20 μL 的蛋白A/G 琼脂糖，在室温下孵育2 h后，进行3 次洗涤，离心去除上清液；加入1× SDS 蛋白上样缓冲液；进行Western blot 实验以检测DJ-1 与ND1和NDUFA4蛋白的相互作用。

3.5 心脏超声检查 造模结束后，使用小动物超声成像系统计算各组大鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

3.6 心肌梗死面积测定 再灌注结束后，迅速取出大鼠心脏，将其切成大约2 mm 厚的薄片，然后将这些薄片放入2% TTC 染液中处理15 min；用多聚甲醛固定心肌组织，并使用相机对其进行拍摄；用ImageJ软件计算心肌梗死面积。

3.7 心脏组织中线粒体ROS 测定 心肌组织冰冻切片用MitoSOX 染液在37 ℃条件下避光孵育30 min后，使用激光共聚焦显微镜对激发和发射信号进行检测，波长分别为498 和522 nm。最后用ImageJ 软件计算相对荧光强度。

3.8 心脏组织中线粒体复合体I活性测定 准备好心肌组织纯化分离提取的线粒体待测样品，置于冰槽里，通过酶标仪调整单波长为340 nm（温度为30 ℃），根据试剂盒说明书计算出线粒体复合体I活性。

3.9 血清中LDH 活性、MDA含量和SOD 活性测定 大鼠造模后，通过心脏穿刺取血，血液在37 ℃条件下静置20 min 后，在4 ℃、3000 r/min 离心20 min，收集血清备用。按照检测试剂盒说明书来测定血清中LDH活性、SOD活性和MDA含量。

4 统计学处理

数据以均数±标准差（mean±SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0 软件进行方差齐性检验和单因素方差分析。P＜0.05表明差异具有统计学意义。

结 果

1 RES预处理对大鼠心功能的影响

心脏超声结果显示，与sham 组相比，I/R 组大鼠LVEF 和LVFS 均显著下降（P＜0.01）；与I/R 组相比，RES+I/R 组 和NC+RES+I/R 组 大 鼠LVEF 和LVFS 均显著升高（P＜0.01）；与RES+I/R 组相比，sh-DJ-1+RES+I/R组和IACS-010759+RES+I/R 组大鼠LVEF和LVFS 均显著下降（P＜0.05 或P＜0.01），即心功能下降，见图1。

Figure 1. Comparison of rat cardiac function in each group. LVEF： left ventricular ejection fraction； LVFS： left ventricular fractional shortening. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图1 各组大鼠心功能的比较

2 RES预处理对大鼠心肌梗死面积的影响

TTC 结果显示，与I/R 组相比，RES+I/R 组和NC+RES+I/R 组大鼠心肌梗死面积显著减小（P＜0.01）；与RES+I/R 组相比，sh-DJ-1+RES+I/R组和IACS-010759+RES+I/R 组大鼠心肌梗死面积显著增加（P＜0.05或P＜0.01），见图2。

Figure 2. Comparison of rat myocardial infarction size in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图2 各组大鼠心肌梗死面积的比较

3 RES 预处理对大鼠血清中氧化应激水平及LDH的影响

与sham 组相比，I/R 组血清中LDH 活性和MDA含量均升高，SOD活性降低（P＜0.01）；与I/R组相比，RES+I/R 组和NC+RES+I/R 组血清中LDH 活性和MDA 含量均降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；与RES+I/R组相比，sh-DJ-1+RES+I/R 组 和IACS-010759+RES+I/R 组血清中LDH 活性和MDA 含量均升高，SOD活性降低（P＜0.05或P＜0.01），见图3。

Figure 3. Comparison of MDA content （A），LDH activity （B） and SOD activity （C） in the serum of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图3 各组大鼠血清中MDA含量、LDH活性和SOD活性的比较

4 RES预处理对大鼠心肌组织线粒体复合体I和线粒体ROS的影响

与sham组相比，I/R组心肌组织中线粒体复合体I活性显著降低，伴随着线粒体ROS的释放水平显著升高（P＜0.01）；与I/R 组相比，RES+I/R 组和NC+RES+I/R 组心肌组织中线粒体复合体I 活性显著升高，伴随着线粒体ROS 的释放水平显著下降（P＜0.01）；与RES+I/R组相比，sh-DJ-1+RES+I/R 组和IACS-010759+RES+I/R 组心脏组织线粒体复合体I活性均显著下降，线粒体ROS 的释放水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），见图4。

Figure 4. Comparison of mitochondrial complex I activity （A） and mitochondrial ROS level （B； MitoSOX staining，scale bar=20 μm） in the myocardial tissue of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图4 各组大鼠心肌组织中的线粒体复合物I活性和线粒体ROS水平的比较

5 RES 预处理对大鼠心肌组织中DJ-1 表达及线粒体转位的影响

接下来通过观察敲减DJ-1表达对RES诱导的心肌保护作用的影响，敲减效率如图5A 所示（P＜0.01）。Western blot 结果显示，与sham 组相比，I/R组大鼠心肌组织中总DJ-1 蛋白水平显著升高，且RES 预处理进一步升高总DJ-1 蛋白水平（P＜0.01），见图5B。

Figure 5. Comparison of DJ-1 expression in the myocardium of rats in each group. A： the knockdown efficiency of sh-DJ-1 in myocardial tissue assessed by Western blot； B： total protein level of DJ-1 detected by Western blot. Mean±SD. n=5. △△P＜0.01 vs sham+NC group； ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图5 各组大鼠心肌组织中DJ-1表达的比较

与I/R 组相比，RES 预处理显著促进DJ-1蛋白在线粒体的转位，这通过DJ-1 在线粒体与胞浆的DJ-1蛋白水平比值升高所证实（P＜0.01），而sh-DJ-1+RES+I/R 组 和IACS-010759+RES+I/R 组DJ-1 蛋 白在线粒体的转位均受到抑制（P＜0.01），见图6。

Figure 6. Comparison of the mitochondrial translocation of DJ-1 in the myocardial tissue of rats in each group. COX IV and GAPDH were used as mitochondrial and cytoplasmic loading controls，respectively. The ratio of mitochondrial DJ-1 protein level to cytoplasmic one was used to assess the translocation of DJ-1 into mitochondria. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.图6 各组大鼠心肌组织中DJ-1在线粒体转位的比较

6 RES 预处理对大鼠心肌组织中DJ-1 与线粒体复合体I核心亚基ND-1和NDUFA4相互作用的影响

免疫共沉淀结果显示，与sham 组相比，I/R 组心肌组织中DJ-1 与ND-1/NDUFA4 的相互作用增强，且RES 预处理进一步增强这种相互作用；与RES+I/R组相比，sh-DJ-1+RES+I/R 组和IACS-010759+RES+I/R 组DJ-1 与ND/NDUFA4 的相互作用均显著减弱，见图7。

Figure 7. Evaluation of the interaction between DJ-1 and ND-1/NDUFA4 in the myocardial tissue of rats in each group.The representative images from five independent experiments were obtained by co-immunoprecipitation assay.图7 各组大鼠心肌组织中DJ-1与ND-1/NDUFA4的相互作用

讨 论

近年来，再灌注疗法是治疗缺血性心脏病最常见和最有效的方法，然而，它也是临床治疗中心肌I/R 损伤的主要原因［18］。心肌I/R 损伤的主要原因已被广泛研究，包括钙超载、炎症、氧化应激等［19］。其中氧化应激在心肌I/R 损伤扮演着越来越重要的角色，心肌I/R 期间ROS的过度生成对心肌细胞造成不可逆转的伤害，从而加剧心功能障碍［20］。已有研究表明，线粒体内产生的ROS是导致I/R 损伤的特殊驱动因素，包括诱导线粒体功能障碍和对其他分子的氧化损伤［21］。值得注意的是，在心肌I/R 期间，线粒体复合体I生成过度的线粒体ROS，从而致使ROS的过度释放［22］。这正如预期，本研究中，心肌I/R 后，线粒体复合体I 活性下降，氧化应激水平增加，表现为血清中MDA 含量增多、SOD 活性下降以及线粒体ROS 的大量释放。许多研究已经表明，RES 作为一种天然多酚化合物，具有多种药理活性，如抗炎和抗氧化作用等，更重要的是，RES 预处理可视为干预心肌I/R损伤的一种重要措施，并且治疗效果显著［23-24］。本研究表明，给予RES 后，上述I/R 诱导的氧化应激损伤现象全部被逆转，同时可改善心功能，缩小心肌梗死面积，有效证实RES可减轻大鼠I/R 诱导的氧化应激损伤，但是其深入机制尚不明确。

DJ-1 在几乎所有生物中均有表达且高度保守，具有伴侣蛋白、氧化还原传感和线粒体稳态活性［25］。敲减DJ-1表达，可明显增加心力衰竭的易损性，从而加剧心功能障碍［26］。有报道称，RES 通过增强DJ-1的表达进而减轻脑I/R 损伤［27］。值得注意的是，之前的研究已经表明，DJ-1作为一种内源性保护蛋白，在H9c2细胞缺氧/复氧后显著上调，并参与缺氧预处理对缺氧/复氧诱导的氧化应激的延迟心脏保护作用［28-29］。在这项研究中，RES 显著促进DJ-1 在心肌I/R 后的表达，同时促进DJ-1 在线粒体的亚定位。值得注意的是，据报道DJ-1在维持线粒体复合体I活性和减轻氧化应激损伤方面发挥重要作用［30-31］。此外，DJ-1 蛋白可以直接与ND1 和NDUFA4 结合，有助于复合体I的组装和功能维持［32］。基于以上报道，可以假设RES的抗氧化应激作用可能是通过DJ-1保持复合体I 活性并随后防止线粒体ROS 产生来介导的。本研究发现，RES增加心肌I/R 后DJ-1在线粒体的易位，之后与ND1/NDUFA4的相互作用增强，进一步支持DJ-1 在RES 在保护线粒体复合体I 活性的潜在作用。随后，与RES+I/R 组相比，心肌内敲减DJ-1表达会使线粒体复合体I活性下降，伴随着氧化应激水平增加，更重要的是，心肌梗死面积扩大，加剧心功能障碍。接下来，为了探讨线粒体复合体I在DJ-1介导RES 预处理的保护作用，对大鼠线粒体复合体I活性进行抑制，结果显示，与RES+I/R 组相比，IACS-010759+RES+I/R 组线粒体复合体I 活性急剧下降，削弱了RES减轻心肌I/R 所致氧化应激损伤的作用，同时加剧心功能障碍。这些数据表明RES 通过DJ-1保护线粒体复合体I 的活性，减弱I/R 诱导的氧化应激，从而具有心脏保护作用。

综上所述，RES 通过上调DJ-1的表达，促进DJ-1在线粒体的亚定位后，与线粒体复合体I的两个亚基ND-1/NDUFA4 的相互作用增强，进而保护线粒体复合体I 的活性，产生对抗I/R 导致的氧化应激损伤的心肌保护作用。