食源性阪崎肠杆菌检测方法研究进展

邓丽萍 邓访萍 张琴

摘 要：阪崎肠杆菌可感染婴幼儿，引发脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。因此，探究出快速、灵敏、高效的阪崎肠杆菌检测方法对于保障食品质量安全至关重要。目前，阪崎肠杆菌的检测方法中比较常见的是分离鉴定法、分子生物学检测技术和免疫学检测法。分离鉴定法易于操作、成本低，但检测周期长，无法满足对目标食品快速检测的需求；分子生物学检测技术是一种高灵敏度和特异性的检测手段，但是由于其对检测人员要求高，所需设备和试剂价格昂贵，目前多在实验室进行，不适用于现场检测；免疫学检测方法简单快捷，适用于现场快速检验，但容易受到其他杂菌的影响，敏感性较低。本文综述了分离鉴定法、分子生物学检测技术、免疫学检测技术等多种阪崎肠杆菌的检测方法，结合参考文献就检测研究进展予以分析，以期为食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法研究提供参考。

关键词：阪崎肠杆菌；检测方法；研究进展

Research Progress in Detection Methods for Foodborne Enterobacter sakazakii

DENG Liping1，2，3， DENG Fangping4， ZHANG Qin1，2，3

（1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Food Industry Institute Limited Company， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China;

4.The First Hospital of Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510080， China）

Abstract： Trace amounts of E. sakazakii can infect newborns and young children， causing meningitis， septicaemia and necrotising small bowel colitis， among others. Therefore， exploring a rapid， sensitive and efficient detection method for E. sakazakii is essential for ensuring food quality and safety. At present， conventional isolation and identification， molecular biology and immunological detection methods for E. sakazakii are more common. The separation and identification method is easy to operate and low cost， but the detection cycle is long， which can not meet the demand for rapid detection of target food. Molecular biotechnology is a highly sensitive and specific means of detection， but due to its high demand for test technicians， the required equipment and reagents are expensive， and is currently mostly carried out in the laboratory， is not suitable for on-site testing. The method of immunological determination is simple and fast， which is suitable for field rapid detection， but it is easy to be interfered with other miscellaneous bacteria and its sensitivity is not high enough. In this paper， separation and identification method， molecular biological detection techniques， immunological detection techniques and other detection methods of E. sakazakii were reviewed， and the research progress of detection was analyzed in combination with references， in order to provide reference for the rapid detection of E. sakazakii in food.

Keywords： Enterobacter sakazakii; detection method; research progress

阪崎腸杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是一种寄生于人和动物肠道内的条件致病菌，在自然界中分布广泛，具有一定的耐热性、耐干燥性、耐高渗环境性，可抵抗超高温瞬时灭菌。奶粉被认为是其主要的传播途径，微量的阪崎肠杆菌（≥3 CFU/100 g）就可能导致感染的发生，可引发新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等病症，甚至会导致严重的神经系统后遗症和发育障碍。来自美国FDA的监测表明，在美国出生体重偏低的新生儿中，阪崎肠杆菌感染率为8.7/10万；而1岁以下婴儿阪崎肠杆菌感染率为1/10万，感染死亡率为20%～50%，1961—2003年全球有案可查的48起婴儿感染事件中，有25起是新生儿感染[1]。因此，探究出一种快速灵敏、简便高效的检测阪崎肠杆菌的方法至关重要。目前阪崎肠杆菌的检测方法主要有分离鉴定法、分子生物学检测技术、免疫学检测技术等[2]。本文将对上述检测方法的研究进展进行对比分析，为建立更加敏感、高效的阪崎肠杆菌检测方案提供参考。

1 分离鉴定法

由于受生物化学、形态等方面的限制，目前国内外对阪崎肠杆菌的分离鉴定主要采用国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）及食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定的方法。2008年我国也制定了阪崎肠杆菌的检验标准，2016年又进行了修正，规范了阪崎肠杆菌的检测[3]。除了这些典型的检测方法，还有在FDA法基础上改进的DFI法，拟以5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷（XαGLC）为发色团，以α-葡萄糖苷酶为底物，通过水解XαGLC，使其呈现特殊的蓝绿色[4]。此外，国内外学者也尝试使用一些相对快速的传统检验方法进行阪崎肠杆菌检测。例如，李洁莉等[5]采用VITEK全自动微生物鉴定系统对阪崎肠杆菌人工污染的婴儿配方乳粉进行检测，把30种生化反应培养基固定到鉴定卡上，依据细菌在鉴定卡各种生化反应孔中生长变化情况，利用数值法判断、针对性识别；宋春美等[6]利用试剂盒实现了乳粉中阪崎杆菌的污染检测等。阪崎肠杆菌的分离与鉴别方法存在耗时长、不易区分、易产生“假阳性”等问题，尽管经过改进，其检出速度及特异性均得到了提高，但仍然存在难以区分的问题。

2 分子生物学检测技术

2.1 单重PCR

聚合酶链式反应检测技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种比较成熟的分子生物学技术，它以细菌特有的毒性基因为模板，通过扩增目标基因实现对阪崎肠杆菌的快速检测。在2003年，KEYSER等[7]首次报道了用基因设计引物序列对阪崎肠杆菌进行PCR扩增检测，这一方法是根据16S rRNA基因序列来设计引物的。

2.2 多重PCR

多重PCR是通过在同一个PCR系统中添加两对或多对引物，实现多个目标基因的同步检测。采用多重PCR方法，通过将不同的引物加入相同的PCR反应中，即可实现对多个病原体的同时检测，并对特定的致病基因进行鉴定，从而极大地提高检测效率。为减少单重PCR可能造成的假阳性结果的出现，叶应旺等[8]基于阪崎肠杆菌，构建了一种以α-1，4-葡萄糖苷酶及OmpA为标靶的双重PCR法，用于快速、准确地测定阪崎肠杆菌。为了提高PCR结果的准确性，ZHOU等[9]利用固定化技术，构建了一种能同时测定3 CFU·mL-1目标菌含量的多重PCR体系。与单重PCR相比，采用双重PCR检测阪崎肠杆菌的方法虽然灵敏度可能有所降低，但可实现快速、准确测定，提高了检测结果的准确性。梁会营等[10]以阪崎肠杆菌ompA基因和金葡菌nuc基因为研究对象，采用双重PCR技术，获得282 bp、482 bp的两个扩增片段；侯殿东等[11]基于阪崎肠杆菌ompA基因、沙门氏菌属侵袭性抗原（invA），建立了能同步检测阪崎肠杆菌与沙门氏菌的双重PCR方法；李洋洋等[12]对反应系统进行了优化，设计3对引物用于多重PCR扩增，实现了对婴儿乳粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌的同时测定。

2.3 荧光定量PCR

美国PE公司于1995年提出了一种核酸定量方法，即通过设计特定的荧光标记探针，或将荧光染料引入反应系统中，对PCR反应中的放大产物进行跟踪检测，并利用热分解曲线软件对扩增产物进行检测，获得最优的模板浓度。PCR检测不仅可以定性，还可以定量。相对于传统PCR，荧光定量PCR具有检测模板数目精确、动力学范围大、敏感性高等优点，可实现对DNA片段存在与否的判定，同时还能测定DNA的拷贝数，进行定量检测，而传统PCR仅能实现半定量；此外，因为PCR是在反应管内进行的，所以荧光定量PCR的研究样品被污染的概率大大降低，也无须通过琼脂糖凝胶电泳来评估，节省了许多操作时间，提高了实验效率。不过，荧光定量PCR也有其局限性，即不能区分是否停止发育和失去活性的细菌。但也不能只关注荧光定量PCR的局限性，就忽略它的特异性，因其特异性，荧光定量PCR已广泛应用于食源性病原菌的检测[13]。SEO等[14]针对阪崎肠杆菌大分子合成操纵子基因，确定了实时荧光PCR法检测阪崎肠杆菌的可行性。利用该技术应用于临床样本中，对目标菌进行检验，均未出现任何错误性的结果，表明其准确性高。2011年，FDA将该方法定为筛选和确认婴儿奶粉中阪崎肠杆菌的一种有效检验方法[15]。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是Notomi于2000年提出的一种核酸放大方法，其基本原理是在目标基因6或8位点上设计4或6个引物，采用替换链DNA聚合酶，使其在恒温条件下1 h即可实现扩增，并根据荧光颜色及浑浊度的变化判断其结果[16]。贺楠等[17]、胡连霞[18]和張宏伟等[19]分别根据阪崎肠杆菌16S rRNA、ITS序列等特异基因，设计出相应的LAMP引物，建立了一种灵敏的LAMP快速检测技术。实验证明，该方法具有较高的特异性和敏感性，操作简单，便于推广。近年来，LAMP技术在疾病诊断、食品安全方面都得到了广泛应用[20]。

2.5 核酸探针技术

2.5.1 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）是一种将细胞原位杂交和荧光相结合的新方法。基于阪崎肠杆菌的16S rRNA基因，ALMEIDA等[21]利用荧光原位杂交方法，构建了多肽核酸分子探针，实现了对婴儿奶粉中阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的快速检测。荧光原位杂交技术弥补了PCR技术无法区分死菌活菌的不足，理论上仅能检测出活菌，且无须从模板DNA中提取，操作简便。同样基于阪崎肠杆菌的16S rRNA基因，VermiconAG公司也设计了一种特殊的荧光标记的基因探针，并将其商品化。

2.5.2 基因芯片

基因芯片技术的原理是通过目标物与已知序列的核酸探针杂交，然后用荧光探测器扫描该信号，从而得到检测结果。基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。基于6种阪崎肠杆菌的 ITS 测序序列及GenBank测序结果，LIU等[22]以ITS为目标片段，设计2对引物，10个探针，选择性富集，检测限可达

1.3 CFU/100 g。该检测技术具有高通量、操作简单快捷、特异性强以及灵敏度高等优点，但是技术复杂、设备价格高、检测限较高、检测重复性差以及应用分析范围窄这些问题还有待解决。

3 免疫学检测方法

免疫学检测是凭借抗原与抗体结合的特异性，对目标物进行定性与定量分析，具有操作简单、灵敏度高、速度快，可同时测定多个样本等特点。免疫磁珠富集法、ELISA法、免疫荧光法、免疫荧光法以及免疫传感法等是免疫学研究的热点。

3.1 免疫磁性微球珠富集技术

免疫磁性微球珠富集技术是通过在磁性微球表面修饰特定抗原（或抗体），使待测样品与其發生特异性反应，通过磁分离，实现对样品的富集。金燕飞等[23]采用阳离子磁珠捕集法对乳粉中阪崎肠杆菌进行了分析，并将其与磁性微球进行偶联，利用磁珠捕获技术实现了对乳粉中阪崎肠杆菌的同步富集，从而缩短了检测时间，提高了对该菌株的检测效率。

3.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）利用抗原（抗体）可以吸附在固相载体上，使其具有一定的免疫活性，而当检测对象被添加到固相载体表面吸附的抗体或抗原中时，则会与这抗原或抗体发生作用，使其发生变色，从而实现对检测对象的定性或定量分析，包括直接ELISA、双抗夹心ELISA、dot-ELISA等。汪琳等[24]制备了抗阪崎肠杆菌单克隆抗体，并初步建立了ELISA检测方法。石曼[25]通过间接ELISA初步研究了阪崎肠杆菌的酶联免疫分析方法，也制备了高效价、高特异性的阪崎肠杆菌多克隆抗体。相对于常规的培养检测方法，ELISA方法快速、灵敏、特异，为食品检验及临床诊断提供了一种新方法，有很好的应用前景。

3.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术的原理是在抗原（或抗体）上标记一种荧光染料，当被检测物与该抗原（或抗体）发生特异作用时，该复合物上就会出现一种荧光物质，通过观察该荧光物质的存在与否，可以判定该抗原或抗体有没有发生特异结合。支援等[26]利用具有特殊光学性质的量子点作为荧光染料，标记免疫磁珠富集阪崎肠杆菌，建立了一种快速检测阪崎肠杆菌的新方法，该方法的整个检测过程仅需要2 h，检测限约为100 CFU·mL-1。

3.4 电化学免疫传感器技术

电化学免疫传感器技术是利用抗体与抗原反应的特异性，将这相互作用转换在电化学传感元件上，利用电感元件将被检测物的浓度信号转化成对应的电信号，从而检测和分析被测物。赵广英等[27]以阪崎肠杆菌为研究对象，制备了一种新型的具有高灵敏度、高选择性、高稳定性且成本低的免疫电极，并将其用于阪崎肠杆菌的检测，为阪崎肠杆菌的快速检测提供了一种新方法。

4 其他技术

随着检测技术的发展，对阪崎肠杆菌的检测已经形成了多种检测手段，还出现了自动化的检测体系，使得阪崎肠杆菌的检测更加便捷、准确和可靠。IVERSEN等[28]通过16S rRNA测序及生物化学特性分析，发现ANN在表型及基因型区分阪崎肠杆菌及近缘细菌的准确率达99.3%，但其分子机制尚不清楚。通过ANN方法对其他具有α-葡萄糖苷酶阳性的阪崎肠杆菌及其他具有α-葡萄糖苷酶活性的菌株进行比较，发现16S rRNA的鉴定准确率可达98.7%，且能获得准确的生物化学特性分析结果。赵红阳等[29]采用基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术，对40株阪崎肠杆菌及1株阴沟肠杆菌进行了测定，其中阪崎肠杆菌包括38株野生阪崎肠杆菌和2株标准菌株。欧静堃[30]制备以阪崎肠杆菌为抗原的胶体金免疫层析试纸条，并以此构建了检测阪崎肠杆菌的快速检测方法。除此之外，还有很多方法可以用于阪崎肠杆菌的检测，包括随机扩增多态性DNA、质粒以及核糖核酸分型等。

5 结语

阪崎肠杆菌常规检测技术所需测试费用较低，对操作者的要求较低，但耗时长、准确度和特异度较低，易产生假阴或假阳性结果，无法满足快速检测的要求。分子生物学检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点，但其对技术人员要求很高，所需的试剂及设备也比较昂贵，多在实验室中使用，不适于现场检验。免疫学分析技术简单、快速，特别是免疫层析试纸条便于携带，适用于现场快速检测，但是容易受到其他杂菌的影响，且灵敏度较低。阪崎肠杆菌的检测方法各有利弊，但随着科技的不断进步和各学科的交叉融合，各种方法的联合应用将会是今后阪崎肠杆菌快速检测的一个重要方向。

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