脊髓小脑性共济失调2两家系致病基因及临床特点

周海涛 牛宇杰 刘德全 潘社红 任向阳 李玉林 王云龙

1）郑州大学附属洛阳中心医院，河南 洛阳471009 2）郑州大学附属洛阳中心医院中心实验室，河南 洛阳471009 3）河南省肿瘤细胞免疫与再生医学国际联合实验室，河南 洛阳471009 4）洛阳市第九人民医院，河南 洛阳471009 5）河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001

脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxias，SCAs）是一组进行性平衡和协调能力障碍的高度遗传异质性疾病，主要症状为行走不稳渐至卧床不起，常伴语言含糊，绝大部分呈常染色体显性遗传，多在成年发病，全球发病率约为3/100 000［1-3］。迄今为止，已报道的SCAs 亚型多达40 余种，其中SCA3/Machado-Joseph disease（MJD）是最常见的亚型，其次为SCA2、SCA1、SCA7 和SCA6，SCA12 和SCA17 亚型少见，SCA8、SCA10 和齿状核-红核-苍白球-路易体萎缩（dentatorubral-pallidoluysian atrophy，DRPLA）罕见［4-6］。国内SCA2 病例偶有报道［7-8］，但河南地区SCA2 报道较少。本次研究采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）结合Sanger 测序方法确诊了两个SCA2家系，并分析其临床特点。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 家系1（4 代29 人）：先证者Ⅲ1，男，40 岁，农民，以“行走不稳3 a，加重2 个月”为主诉就诊，诉走路醉酒感。神经系统体格检查：神志清，认知功能正常，言语不清，脑神经阴性，四肢肌力、肌张力正常，腱反射对称++，双侧指鼻试验、跟膝胫试验均差，直线行走困难，闭目难立征阳性，深、浅感觉无异常，巴宾斯基征阴性。

家系情况：先证者祖母Ⅰ2，有行走不稳症状，发病及去世年龄不详；先证者父亲Ⅱ1，72岁，因不能行走已卧床5年余；Ⅱ3、Ⅱ5均有类似症状，已故；Ⅲ6，女，37 岁，言语不清，行走正常；Ⅲ10，女，32 岁，行走不稳3年余，持物不稳，张嘴后闭合困难；Ⅲ11，男，35岁，行走不稳10 余年，已卧床；Ⅲ12，男，32 岁，间断头痛、头晕；Ⅳ1，男，16岁，目前正常；Ⅳ2，男，15岁，记忆力下降2 a，行走正常。见图1。

图1 家系1家系图Figure 1 Diagram of the pedigree 1

1.1.2 家系2（4 代14 人）：先证者Ⅱ3，男，66 岁，退休，以“言语不清、行走不稳2 a，加重6 个月”为主诉就诊。神经系统体格检查：神志清，认知功能正常，言语不清，脑神经阴性，四肢肌力、肌张力正常，腱反射对称++，双侧指鼻试验、跟膝胫试验均差，直线行走困难，闭目难立征阳性，深、浅感觉无异常，巴宾斯基征阴性。

家系情况：先证者父亲Ⅰ1，有行走不稳症状，已故；Ⅱ1、Ⅱ2均正常；Ⅱ5、Ⅱ7有类似症状；Ⅲ1、2、3、4和Ⅳ1均正常。见图2。

图2 家系2家系图Figure 2 Diagram of the pedigree 2

1.2 方法

1.2.1 样本采集及血液基因组提取：签署知情同意书后用EDTA抗凝管抽取外周血2～3 mL，放置于—80 ℃冰箱保存或直接进行血液基因组提取。DNA提取按天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行。使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计对提取DNA浓度进行测定，A260/A280比值在1.8～2.0提示样本纯度较高，可进行后续试验。

1.2.2 引物、PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger 测序：SCA1、2、3、6、7、12、17、DRPLA 亚型特异性引物（表1）由华大基因合成。PCR反应体系为25 μL：TaKaRa LA Taq（5 U/μ L）0.25 μ L，2×GC Buffer1 12.5 μ L，dNTP Mixture（2.5 mmol each）4 μL，DNA 模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，最后加入ddH2O水补足体积。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，以表1中的退火温度退火45 s，72 ℃延伸60 s，循环35次；72 ℃终末延伸7 min。取10 μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm，60 min，凝胶成像系统观察、拍照。异常条带切胶送华大基因进行Sanger测序验证，先证者确诊后对其余家系成员进行验证。

表1 SCA1、2、3、6、7、12、17、DRPLA亚型特异性引物序列Table 1 Specific primers sequence of SCA subtype 1，2，3，6，7，12，17 and DRPLA

2 结果

2.1 SCA2 亚型的确定首先对以上两个家系先证者进行SCA1、2、3、6、7、12、17 和DRPLA 亚型筛查，各亚型基因PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示ATXN2 基因存在两条分子量差别较大的条带，提示SCA2 型可能性大（数据未展示）。分子量较大的电泳条带切胶后送公司行Sanger 测序，结果显示家系1 先证者ATXN2 PCR 产物CAG 重复次数为44 次（图3A），家系2先证者ATXN2 PCR产物CAG重复次数为38次（图3B），均大于可致病的最低CAG重复次数33次。

图3 两家系先证者ATXN2基因PCR产物Sanger测序图（反向引物）Figure 3 Sanger sequencing of PCR product of ATXN2 gene in the two probands（reverse primers）

2.2 家系验证先证者确诊后对其部分家系成员进行验证。家系1 部分成员琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，先证者（Ⅲ1）及其儿子（Ⅳ1）、二叔大女儿之子（Ⅳ2）、二叔之小女儿（Ⅲ10）均检测到异常扩增条带，其三叔之小儿子（Ⅲ12）及对照样本均未检测到异常扩增条带。对异常条带进行Sanger 测序显示Ⅲ1 CAG 重复次数为44次，Ⅳ1 CAG 重复次数为44 次，Ⅳ2 CAG 重复次数为42 次，Ⅲ10 CAG 重复次数为41 次，对Ⅲ12 电泳条带测序结果显示CAG重复次数为22 次，对照样本电泳条带测序结果显示CAG 重复次数为18次。

家系2 部分成员琼脂糖凝胶电泳结果如图5 所示，先证者（Ⅱ3）及其妹（Ⅱ7）检测到异常扩增条带，其子（Ⅲ1）、女（Ⅲ2）、外孙女（Ⅳ1）及其妹之子均未检测到异常扩增条带。对其妹的异常电泳条带进行Sanger 测序显示CAG 重复次数为38 次，对Ⅲ1 的正常条带行Sanger测序显示CAG重复次数为22次。

图5 家系2 部分成员ATXN2 基因PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 5 Agarose gel electrophoresis of ATXN2 gene PCR product from part number of pedigree 2

3 讨论

本研究按照文献的遗传性共济失调基因诊断流程［1］，首先采用PCR 和琼脂糖凝胶电泳对洛阳地区两个遗传性共济失调家系进行SCA 1、2、3、6、7、12、17 和DRPLA 亚型的筛选，初步确定为SCA2 亚型后进行Sanger 测序验证，最终发现两个SCA2 家系，此方法与二代测序相比简便易行、准确性高，实验条件要求不高，便于医院推广应用进行临床诊断及产前筛查。河南地区SCA2家系报道较少，本研究完善了全国范围内SCA2 家系的河南数据，为今后SCA2 的流行病学、临床特征、发病机制及治疗等方面的研究提供重要遗传资源。另外，长期以来，作为外迁人员较大的地区，河南地区SCA2 家系是否对外地SCA2家系产生奠基者效应值得进一步研究。

SCA2 致病等位基因上CAG 重复数目与发病原因和发病年龄密切相关［9-11］。SCA2为常染色体显性小脑性共济失调（autosomal dominant cerebellar ataxia，ACDA）的一种，致病基因为ATXN2，编码Ataxin-2蛋白，目前公认的发病机制为ATXN2基因编码区第一外显子CAG 重复次数超出正常范围，导致翻译出有毒性的多聚谷氨酰胺蛋白，对小脑和脊髓甚至其他中枢和（或）外周神经细胞造成损害，属于多聚谷氨酰胺蛋白疾病（PolyQ）［12-15］。ATXN2 基因由英国、美国和古巴学者于1993 年通过对古巴一个SCA大家系进行连锁分析后定位于12q23-23.1位置［16］，此后，1996年3个独立的研究团队分别克隆了该致病基因［17-19］。古巴学者对其本国578个SCA2家系的分子遗传特征分析后发现正常等位基因CAG 重复次数13～31 次，最常见的为22 次重复，而致病等位基因CAG 重复次数32～79 次，最常见的为37 次重复［20］。王俊岭等［21］对300名健康人群进行ATXN2基因CAG重复次数测定，结果显示CAG 重复次数14～28 次，SCA2 患者CAG 重复次数32～79 次。本研究中的2个家系成员正常等位基因CAG重复次数18～22次，致病等位基因CAG重复次数38～44次，与国内外研究结果一致。

PolyQ类疾病具有遗传早现的特点［3］，SCA2也不例外，其主要机制在于不论致病等位基因来自于父亲还是母亲，CAG 重复次数在代间遗传时具有高度不稳定性，且最终结果几乎都是CAG 重复次数的增加，导致更具毒性的多聚谷氨酰胺蛋白聚集，使得发病年龄提前［22-24］。上述机制只能解释57%的遗传早现，Pulst 等［25］研究发现SCA6 的致病基因CACNA1A钙通道亚单位CAG 重复次数的增加对SCA2 的遗传早现有协同作用，可以解释约6%的遗传早现，剩下约37%的遗传早现仍需进一步研究。本研究家系1中第2 代50 岁左右发病，第3 代30 岁左右发病，第4代中的Ⅳ2 15 岁即出现记忆力下降症状，存在遗传早现情况，但已经检测的第3代与第4代患者在CAG重复次数方面并无明显变化，是否存在CACNA1A基因的协同作用还是其他原因，需进一步研究。家系2中仅第2代部分成员存在共济失调症状，第3代均无症状，且检测结果正常，无法确定有无遗传早现情况。

按1982年的Harding ADCA分类标准［26］，根据有无小脑外系统损害症状及视网膜色素变性ADCA可分为3类，ADCA1即共济失调合并锥体束征、锥体外系症状或肌萎缩类型，ADCA2 即共济失调合并视网膜色素变性类型，ADCA3 即单纯共济失调类型。根据以上分类标准，SCA2 属于ADCA1 型，其症状复杂多样，除共济失调外，可能合并其他神经系统损害症状［27］。本研究中的两个家系均以行走不稳为主要症状，部分成员伴言语不清、记忆力下降，未观察到肌萎缩。

总之，本研究采用PCR 结合Sanger 测序方法检测到洛阳地区两个SCA2家系，其主要临床特点为家族性的行走不稳。本研究完善了全国范围内SCA2家系的河南数据，为今后SCA2 的流行病学、临床特征、发病机制及治疗等方面的研究提供重要遗传资源。