HPLC 法同时测定R-四氢罂粟碱中的8 种有关物质

2024-01-14杜文哲徐嘉健张福利杨文亮林丽娅

广州化学 2023年6期

杜文哲，徐嘉健，张福利，杨文亮，林丽娅

（1.上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620；2.上海医药工业研究院有限公司，上海 201203；3.杭州博崤生物制药有限公司，浙江杭州 311404 ）

苯磺顺阿曲库铵是一种高效的肌肉松弛剂[1]，该药物的合成是以R-四氢罂粟碱（5）作为原料，因此，5 的质量控制是该药物质量保证的关键[2]。本课题组前期开发了一锅法合成四氢罂粟碱盐酸盐，再通过拆分合成5 的工艺[3]，合成路线及路线中涉及杂质如图1 所示。

图1 5 的合成工艺路线及相关杂质结构

四氢罂粟碱的相关研究多集中于合成工艺优化[4-5]，文献中并未对相关杂质进行研究。现有对于异喹啉类化合物检测的文献中，多是对其含量检测[6-8]。关于异喹啉类的检测，刘学起等[9]用HPLC 对盐酸罂粟碱的含量进行检测，缺少对于有关物质的同时检测的方法；王瑶等[10]用HPLC-MS联用技术对盐酸罂粟碱注射剂的含量以及一个有关物质进行检测，对于杂质研究不够深入。目前对于异喹啉类化合物及其杂质同时定量的分析方法未见报道。

参考以上方法，本文使用常规的HPLC 对优化后5 的合成工艺中的8 个有关物质进行分析方法开发与验证工作，以期为苯磺酸顺阿曲库铵的工业化生产提供参考。

1 实验

1.1 试剂与仪器

试剂：1（安徽德信佳生物医药有限公司，批号：GLA-220502，含量98.01%）；2（安徽德信佳生物医药有限公司，批号：GLS-210801，含量99.88%）；3（自制经标化，批号：210922-2-1，含量99.71%）；4（自制经标化，批号：220613-1-1，含量 97.68%）；6（自制经标化，批号：210909-1-1，含量98.79%）；7（自制经标化，批号：220223-1-2，含量98.11%）；8（自制经标化，批号：220927-2-2，含量99.01%）；9（自制经标化，批号：220315-2-2，含量99.70%）；5 对照品（自制经标化，批号：220914-1-1，含量：99.73%）；5 样品（自制待检测，批号：210603-1-1-6、210609-1-1-4、210609-1-2-4）。各化合物合成均依据文献记载[3]。

试剂：甲酸铵，AR，Adamas-beta；甲醇，色谱纯，Adamas-beta；乙腈，色谱纯，Adamasbeta；无水甲酸，分析纯，麦克林；蒸馏水，娃哈哈公司。

仪器：高效液相色谱仪，U3000 型，美国Thermo Fisher Scientific 公司；分析天平，XPR205型，瑞士METTLER TOLEDO 公司；Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

1.2 色谱条件

Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以10.0 g/L的甲酸铵-乙腈（100∶5）为流动相A，甲醇为流动相B，柱温37℃，检测波长280 nm，流速为1.0 mL/min，进样量10 μL，梯度洗脱（0.0-40.0 min，A 90%-43%；40.0-50.0 min，A 43% ；50.0-50.1 min，A 43%-90% ；50.1-60.0min，A 90%）。

1.3 溶液配制

稀释剂（33.3 g/L 甲酸铵∶甲醇∶乙腈=6∶2∶2）：称取19.7 g 甲酸铵，加水590 mL，加入10 mL 无水甲酸后，加入甲醇、乙腈各200 mL，摇匀即得。

供试品溶液（1 mg/mL）：精密称取5 样品（批号：210603-1-1-6）5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。

对照品溶液（1 mg/mL）：精密称取5 对照品5 mg，置于5 mL 量瓶中，使用稀释剂定容，作为5 的对照品溶液；精密称取1、2、3、4、6、7、8、9 对照品各5 mg，分别置于5 mL 量瓶中，1、2、3、4、7、8、9 使用稀释剂定容；6 使用1 mL二氯甲烷溶解后，使用乙腈定容，作为各杂质对照品溶液。

杂质混合对照品储备液（20 μg/mL）：分别移取1、2、3、4、6、7、8、9 对照品溶液各500 μL置于25 mL量瓶中，使用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。

系统适用性溶液：称取5 对照品20 mg，置于20 mL 量瓶中，加入杂质混合对照品储备液1mL后，用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。

对照溶液（0.1%自身对照溶液）：取供试品溶液100 μL 置于100 mL 量瓶，加入稀释剂定容至刻度，摇匀即得。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

采用DAD 对5 和6 进行全波长扫描，结果如图2 所示。图谱显示，5 的最大吸收波长为192 nm、231 nm、281 nm；6 的最大吸收波长为194 nm、230 nm、281 nm、320 nm，1、2、3、4、7、8、9的最大吸收波长与6相似，考虑到低波段容易对检测造成干扰；在231 nm 处，有空白峰干扰检测；综合上述并结合各国药典中对苯磺顺阿曲库铵检测时的波长选择，最终选择280 nm 作为5 有关物质的检测波长。

图2 5、6 的紫外吸收光谱

2.1.2 色谱柱的筛选

从待测物的结构式可知，除化合物2 含有羧基外，每个化合物均含有氨基，极性相对较强，各化合物结构近似，极性接近。对于填料进行筛选，C18填料的色谱柱相较于C8具有更好的保留，并查阅各国药典中对盐酸罂粟碱以及苯磺顺阿曲库铵的有关物质方法中均使用C18填料色谱柱，因此选择使用C18填料色谱柱。

对各国药典中记载的苯磺顺阿曲库铵有关物质检测所使用色谱柱及色谱方法进行尝试，分别使用了Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm，中国药典）、YMC-UltraHT Hydrosphere C18（3.0×100 mm，2 μm，欧洲药典）以及Kromasil 100-5-C18（4.6×250 mm，5 μm，美国药典）三种色谱柱，重现结果见图3。

图3 系统适用性溶液典型色谱图：a.中国药典重现结果；b.欧洲药典重现结果；c.最终确定方法结果

图3a 为Eclipse Plus C18色谱柱重现结果，图谱显示峰形相对较差，且分离度不佳；图3b 为YMC-UltraHT Hydrosphere C18色谱柱重现结果，图谱显示各化合物的保留较弱，从而导致分离度不合格；Kromasil 100-5-C18色谱柱峰形良好，但分离度不够理想。因此，以此为基础对色谱条件进行优化，并确定了最终色谱条件，如图3c 所示，各化合物分离度均大于1.5，因此，选择该色谱柱来测定5 中的有关物质。

2.2 线性等参数考察

2.2.1 线性与范围

移取“1.3”项下的各对照品溶液，加稀释剂分别配置为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、10.0 μg/mL的线性溶液，按照“1.2”项下色谱条件检测。以峰面积为纵坐标，线性溶液的质量浓度为横坐标，绘制各化合物的标准曲线，结果见表1。

表1 各化合物线性回归方程

2.2.2 重复性检验

按照“1.3”项下配置系统适用性溶液，平行配置6 份，按照“1.2”项下色谱条件检测，计算单杂和总杂含量，并计算其RSD 值。结果显示，1、2、3、4、6、7、8、9 的RSD 分别为3.7%、0.0%、3.1%、3.7%、4.5%、4.7%、4.1%、3.4%，总杂含量RSD 为3.9%，表明方法重复性良好。

2.2.3 中间精密度检验

由两名分析人员在不同日期检测5，分别平行配置6份系统适用性溶液以及0.1%自身对照溶液，重新配置稀释剂和流动相并且使用不同仪器，按照“1.2”项下色谱条件检测，计算2 个分析人员制备的12 份样品的RSD 值。结果显示，6 份样品的RSD 均小于10%，且12 份样品中，1、2、3、4、6、7、8、9 含量的RSD 值分别为4.7%、4.3%、4.6%、6.4%、6.4%、4.1%、5.1%、5.6%，总杂质含量的RSD 为5.0%，表明方法的中间精密度能达到要求。

2.2.4 检测限与定量限

将各杂质的对照品溶液用稀释剂逐步稀释成一定浓度的溶液，在“1.2”项下色谱条件检测，记录色谱图。信噪比（S/N）为3～10时测得的量为其检测限，S/N≥10 时测得的量为其定量限。结果显示，1、2、3、4、5、7、8、9 检测限为0.20 μg/mL，6 检测限为0.10 μg/mL；1、2、3、4、5、7、8、9 定量限为0.50 μg/mL，6 定量限为0.25 μg/mL。定量限连续进样6 次，1、2、3、4、5、6、7、8、9 的RSD 分别为2.5%、1.1%、2.9%、2.8%、1.2%、3.5%、3.2%、1.6%、1.9%。

2.2.5 准确度试验

分别精密称取5 对照品20 mg 置于20 mL 量瓶，共11 份。前两份直接用稀释剂定容，其余9份，分别加入“1.3”项下杂质混合对照品储备液250 μL、500 μL、750 μL，使用稀释剂定容，配置为50%（0.5 μg/mL）、100%（1.0 μg/mL）、150%（1.5 μg/mL）杂质限度的加标溶液，每个浓度平行配置三份。该11 份溶液分别配置0.1%自身对照，即取100 μL 置于100 mL 容量瓶中，用稀释剂定容至刻度制得。按照“1.2”项下色谱条件检测，以0.1%自身对照法计算平均回收率。结果显示，1、2、3、4、6、7、8、9 的平均回收率分别为 93.0%、99.2%、104.9%、102.0%、96.3%、101.8%、102.5%、98.6%；RSD 分别为 3.4%、3.2%、3.5%、3.0%、2.6%、3.9%、3.1%、3.8%。

2.2.6 耐用性试验

取“1.3”项下系统适用性溶液及其0.1%自身对照溶液，按照“1.2”项下色谱条件检测，分别考察了柱温（37±2）℃、流速（1.0±0.1）mL/min、流动相A 起始比例（10±2）%、检测波长（280±2）nm对于分离效果的影响。结果显示，不同耐用性色谱条件下，各杂质与5 分离度均大于1.5，单个杂质的绝对差值≤0.02%，总杂质绝对差值≤0.1%，说明方法耐用性良好。

2.2.7 溶液稳定性

取“1.3”项下系统适用性溶液及0.1%自身对照溶液，按“1.2”项下色谱条件检测；并将加标样品溶液分别置于室温、低温（10℃）环境下，定时检测。结果显示，在室温条件下，27 h 稳定；低温（10℃）条件下25 h 稳定，所有杂质含量变化均在0.01%范围内，总杂质绝对差值为0。