湛江地区高毒力肺炎克雷伯菌分子流行特征

邓 晨 戴家泽 邱丽红 沈威廷 蔡木发 罗文英

（1.广东医科大学，广东 湛江 524000；2.广东医科大学附属医院检验医学中心，广东 湛江 524000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是医院常见的革兰阴性杆菌，属于条件致病菌，可通过质粒的接合转移获得与抗菌药物耐药性或毒力相关遗传物质，从而进化为一种新的致病型[1]。目前，临床主要流行2种类型的KP，分别是经典型肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumoniae，CKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）。与CKP比较，hvKP的致病力和传播性更强，可致较高的患病率和患者死亡率[2]。hvKP自20世纪80年代开始广泛流行，目前已成为一个严重的全球性公共卫生问题，且由于抗菌药物的不当使用，兼具高毒力和耐药性的碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）已经出现[3-4]，给临床治疗带来了巨大的挑战。本研究旨在了解湛江地区hvKP的分子流行特征，分析其耐药特征，以及感染患者的临床特征，为湛江地区合理防治hvKP感染提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2021年6月—2022年6月湛江市2家三级甲等医院住院患者不同临床样本中分离出的非重复KP菌株和感染患者的临床资料，将拉丝试验和毒力基因（rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344）阳性的KP纳入hvKP组，其他KP菌株纳入CKP组。

1.2 制备DNA模板

采用水煮法制备DNA模板，检测DNA浓度和纯度，以A260nm/A280nm≈1.8为合格。

1.3 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

参考文献[5]设计hvKP6 个毒力基因（rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344）和6个荚膜血清型基因（K1、K2、K5、K20、K54、K57）引物（表1），委托生工生物工程（上海）有限公司合成引物。PCR总反应体系为50 μL，包括25 μL 2x PCR mix、4 μL DNA模板，上、下游引物各2 μL，17 μL ddH2O。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸1 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析仪（美国赛默飞世尔科技公司）观察电泳结果，并拍照保存。

表1 hvKP毒力基因、荚膜血清型基因和管家基因引物序列

1.4 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）

参考MLST网站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）上描述的方法，采用PCR扩增hvKP的7个管家基因（gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi和rpoB）（管家基因引物序列见表1），扩增产物送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，将测序结果上传至MLST数据库，得到7个等位基因型和ST型别。

1.5 体外药物敏感性试验

采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司）进行菌株鉴定和药物敏感性试验，参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关标准[5]判读结果。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）购自广东省临床检验中心。

1.6 统计学方法

使用SPSS 26.0软件进行统计分析。计数资料用例或率表示，组间比较采用χ2检验。呈正态分布的计量资料用±s表示，组间比较采用独立样本t检验。呈非正态分布的计量资料用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-whitneyU检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株收集和分组结果

共收集175株非重复KP临床分离株，其中48株（27.43%）纳入hvKP组，127株（72.57%）纳入CKP组。hvKP组菌株主要来源于重症监护病房（14.58%，7/48），CKP组菌株主要来源于老年科（12.60%，16/127）。hvKP组和CKP组主要样本类型均为痰液，分别占62.5%（30/48）和33.07%（42/127）。

2.2 hvKP组荚膜血清分型结果

hvKP组以K1荚膜血清型为主，占62.50%（30/48），其次是K2、K57、K20和K54，分别占16.67%（8/48）、12.50%（6/48）、6.25%（3/48）和2.08%（1/48），未检出K5型hvKP，部分菌株荚膜血清型基因扩增结果见图1。

图1 荚膜血清型基因电泳图（部分）

2.3 hvKP组MLST结果

hvKP组菌株共检出11种ST型别，以ST23型为主，占58.33%（28/48），全部属于K1荚膜血清型。见表2。

表2 48株hvKP组MLST和荚膜血清型

2.4 hvKP组和CKP组体外药物敏感性试验结果

hvKP组菌株对临床常见的9种抗菌药物敏感率明显高于CKP组，对阿米卡星、亚胺培南和头孢哌酮-舒巴坦的敏感率为97.92%（47/48），对头孢他啶、替加环素和哌拉西林-他唑巴坦的敏感率为95.83%（46/48），对头孢吡肟、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑的敏感率为93.75%（45/48）；超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum beta-lactamase，ESBL）耐药表型携带率为4.17%（2/48），与CKP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。hvKP组检出1株CRhvKP。见表3。

表3 hvKP组与CKP组对抗菌药物的敏感性和耐药表型携带情况比较 株（%）

2.5 hvKP组和CKP组患者临床特征比较

hvKP组和CKP组患者性别、年龄和预后差异均无统计学意义（P＞0.05）。在感染类型方面，hvKP组以社区感染为主，CKP组以医院感染为主（P=0.035）。在并发症和基础疾病史方面，hvKP组比CKP组更容易并发肝脓肿和血流感染（P＜0.05），但hvKP组通常无泌尿系统基础疾病史。在感染发生部位方面，hvKP组发生呼吸道感染、血流感染、肝胆道感染和全身多部位感染的比例明显高于CKP组（P＜0.05），但CKP组发生泌尿道感染的比例高于hvKP组（P＜0.05）。实验室指标检测结果比较，hvKP组白细胞总数、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶明显高于CKP组（P＜0.05）。见表4。

表4 hvKP组与CKP组患者临床特征比较

3 讨论

hvKP的定义目前尚未达成共识，临床微生物实验室一般基于高黏液表型的拉丝试验来定义hvKP，但存在错检和漏检的风险。RUSSO等[6]发现，位于毒力质粒上的毒力基因具有高度特异性和遗传稳定性，可作为鉴定hvKP的生物标志物，其中毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB和peg344的诊断准确率均超过95%。因此，本研究以毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344作为鉴定hvKP的生物标志物，发现此方法筛选出的hvKP感染患者更容易发生全身多部位感染、肝脓肿、脓毒血症等并发症，且白细胞计数、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶也明显高于CKP组，证明了采用拉丝试验和鉴定上述6种毒力基因的方法能够有效筛选出hvKP菌株。

本研究分离鉴定的hvKP菌株具有基因多样性，以K1-ST23型hvKP[58.33%（28/48）]为主要流行毒株。有荟萃分析结果显示，K1型和ST23型是中国hvKP分离株中最常见的荚膜血清型和ST型别[7]。然而，K1荚膜血清型在hvKP中流行率高的原因尚不清楚，可能与肠道定植有关。另外，K1荚膜血清型hvKP可能与肝脓肿密切相关，本研究中，引发肝脓肿的9株hvKP中有7株属于K1荚膜血清型。CHUNG等[8]认为，K1荚膜血清型侵袭性KP是引发韩国人群肝脓肿的主要病原体。因此，建议在临床工作中应注意K1/K2荚膜血清型hvKP感染患者合并肝脓肿的风险。此外，hvKP相关肝脓肿治疗的关键在于及时引流脓液，但是由于hvKP具有高黏液样特性，建议临床选择更大口径的引流管，并勤冲洗，避免堵管。

由毒力基因rmpA和rmpA2参与编码的荚膜多糖是hvKP的重要毒力因子之一，过量产生的荚膜多糖作为包裹在菌体表面的一种物理屏障，不仅能够帮助hvKP逃避宿主免疫反应，还能限制水平基因的转移[9]。耐药基因的转移障碍可能是导致本研究中hvKP比CKP更不容易产生抗菌药物耐药性的原因。值得注意的是，本研究检出了1株CR-hvKP，这种同时具有高毒力、多药耐药性和高度传播性的菌株在医院环境中的传播是具有致命性的。浙江省某三级甲等医院重症监护病房曾发生ST11型CR-hvKP引发的严重的呼吸机相关性肺炎，导致5例患者死于严重肺部感染、多器官衰竭或感染性休克[10]。提示在临床工作中应重视此类情况，及时采取控制措施，阻止其在社区和医院环境中进一步传播，并合理使用抗菌药物。另外，尽管本研究中hvKP菌株大多对抗菌药物敏感，但仍有20.83%的患者死亡，这可能是因为菌株毒力过强，患者疾病进展迅速，而且在感染初期临床并不知道该种菌株是“高毒力的”，因而未及时采取针对性治疗措施。许多隐匿部位的脓肿，如hvKP相关化脓性眼内炎、脑膜炎和前列腺炎，需要达到足够的药物浓度才能获得最佳的疗效。因此，临床微生物实验室及时鉴定出hvKP菌株对于hvKP相关化脓性感染患者的治疗和预后具有非常重要的临床意义。

尽管本研究中hvKP组患者以社区感染为主，但hvKP感染向医院感染转变的这种情况已经发生。有研究发现，日本7家不同医院的hvKP感染中，超过50%与医院感染有关[11]。发生这种情况的可能原因是广泛耐药CKP菌株通过获得hvKP毒力质粒，进化为广泛耐药hvKP菌株。如果这种高毒力菌株取代CKP成为卫生保健环境中的主要定植菌，势必会增加住院患者的感染风险，从而导致hvKP感染发病率和患者死亡率的增加。此外，男性似乎比女性更容易感染KP，本研究中，无论是hvKP组，还是CKP组，感染患者均以男性居多，这一点在其他研究中也得到了验证[12-13]，造成这种性别分布差异的原因有待进一步研究。另外，本研究还发现，CKP组有泌尿系统疾病史，以及发生泌尿道感染的比例明显高于hvKP组，这可能与CKP的耐药性及其感染特性有关。广泛耐药的CKP菌株普遍存在于医疗卫生保健环境中，可以定植于患者的结肠和会阴部，通过上行途径导致泌尿道感染，并且CKP造成的这种尿路感染往往是局部的，很少随着血流传播导致其他部位发生继发感染。

本研究还存在不足之处，首先是样本量不足，且持续时间仅为1年，不是多中心研究；其次是本研究中关于hvKP的定义可能过于“严苛”，在进行毒力基因检测时，我们发现有部分黏液型KP并未同时携带6种毒力基因，从而未被纳入hvKP组，而且这部分菌株实际的毒力情况我们并未考证，可能造成了漏检。另外，由于本研究中的KP菌株均收集于医院环境，在抗菌药物的作用下大部分CKP菌株已经转变为碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌菌株，这种多药耐药型菌株也会造成很高的病死率，这也解释了为什么本研究中2个组感染患者预后并未出现太大差别。

综上所述，K1-ST23型是湛江地区hvKP优势流行株。hvKP较CKP对抗菌药物更敏感，hvKP感染患者更易出现全身多部位感染和肝脓肿，以及血流感染等并发症，其感染相关指标水平偏高，且伴有肝功能损伤，临床应加以重视。