萝卜硫素减轻子宫内膜异位症大鼠模型的慢性机械性疼痛

康 乐 戴 虹 苏婷婷

(同济大学附属杨浦医院妇产科,上海 200000)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是临床常见的一种妇科疾病,是指本该生长在子宫内的内膜组织长到了宫腔以外,比如卵巢组织、输卵管或盆腔等,这种情况会导致女性出现痛经、盆腔痛、不孕等现象,还会增加卵巢癌患病风险,给女性身心健康带来很大困扰[1]。EMs的致病因素较为复杂,引发的疼痛临床治疗难度较大,如何能够有效减轻或缓解EMs及疼痛,是目前众多学者关注的一个热点。萝卜硫素是一种异硫氰酸盐,研究发现,萝卜硫素具有抗炎、抗氧化、调控细胞增殖/凋亡等作用,并且对于乳腺癌、前列腺癌等癌症具有较好的防治效果[2]。有研究[3]发现,萝卜硫素对EMs具有一定的保护作用,而且目前关于萝卜硫素对EMs的保护机制研究较少。因此,本实验通过建立大鼠EMs模型,研究萝卜硫素是否能够减轻EMs大鼠的机械性疼痛及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:8～9周龄雌性SPF级SD大鼠90只,体质量(200±20)g,由常州卡文斯实验动物有限公司提供,生产许可证号【SCXK(苏)2016-0010】。所有大鼠均饲养在同济大学附属杨浦医院动物房内,动物使用许可证号【SYXK(沪)2020-0002】,饲养环境:室温20～26 ℃,湿度40%～70%、光照条件采用12 h/12 h昼夜间断照明。研究已由机构动物护理和伦理委员会审核批准,伦理审批号:20230923,遵循《实验动物的护理和使用指南》,并按实验动物使用的“3R”原则给予人道的关怀。

1.1.2主要试剂与仪器:萝卜硫素(YG10777)(上海韵泰信息科技有限公司);HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)(深圳海思安生物技术有限公司);TLR4抑制剂TAK-242(上海吉至生化科技有限公司);HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA试剂盒(SEKM-0145、SEKM-0034、SEKM-0007、SEKM-0010)(北京索莱宝科技有限公司);兔抗HMGB1(ab18256)、兔抗TLR4(ab13556)、兔抗MyD88(ab13556)、兔抗TPRV1(ab6166)、山羊抗兔IgG(ab150077)(Abcam公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)(碧云天生物工程有限公司)。Von Frey电子测痛仪(上海玉研仪器公司);低温高速离心机(湖南凯达离心机厂);荧光化学发光成像系统(上海培清科技公司)。

1.2 方法

1.2.1EMs模型的构建:取正常大鼠,造模前连续5 d灌胃0.02 mg/kg己烯雌酚,使大鼠处于动情期。参照大鼠EMs[4]造模方法,大鼠采用腹腔注射1%戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉后固定,对腹部皮肤进行脱毛并消毒,在尿道上端1～2 cm处,纵向切开皮肤及腹壁,暴露左侧子宫,离卵巢1 cm处剪取2 cm子宫,断端结扎。将所取子宫组织置于洛氏营养液中,剪取5 mm×5 mm内膜固定并缝合在腹壁上,之后使用0.9%氯化钠溶液对移植部位进行冲洗,缝合切口。另设Sham组,取正常大鼠,与上述操作相同,但不进行内膜移植,仅在开腹后,在离卵巢1 cm处剪取2 cm子宫并对其断端进行结扎。术后腹腔注射1.6×105U/kg青霉素以防感染。所有大鼠手术后正常喂养。子宫内膜组织异位后会因积液产生凸起,积液高度>1.5 mm,表示模型构建成功。建模后,每组随机选择3只大鼠于动情期再次开腹观察移植物生长情况。饲养和造模过程中共有21只大鼠死亡,其中萝卜硫素低剂量组的大鼠存活只数最少,为10只,故后续每组取10只大鼠进行指标检测。

1.2.2分组及给药:将造模成功的大鼠随机分为5组,每组10只,包括:EMs组、萝卜硫素低、高剂量组、HMGB1抑制剂组(EP组)、TLR4抑制剂组(TAK-242组)。Sham组大鼠同样为10只。将萝卜硫素使用0.9% 氯化钠溶液进行稀释,每日通过灌胃方式给药:萝卜硫素低、高剂量组大鼠分别给予5 mg/kg和15 mg/kg萝卜硫素;Sham组和EMs组每日灌胃相同体积0.9% 氯化钠溶液;EP组和TAK-242组每隔一日分别腹腔注射40 mg/kg的EP溶液和3 mg/kg的TAK-242溶液。各组均给药14 d。

1.2.3机械痛阈的测量:将大鼠放置在塑料固定箱(466 mm×300 mm×215 mm)中,固定箱除底部为金属铁架外,其余皆为透明塑料板。待放入30 min适应环境后开始测定。通过电子测痛仪来检测,将探针从底部沿金属栏边缘刺向大鼠后爪脚掌正中匀速施加压力,大鼠出现缩爪、逃跑或尖叫时记录此时压力值。此压力值即为机械痛阈值(paw withdrawal threshold,PWT)。每只大鼠重复测定3次,每次测量时间间隔30 s,取平均值。

1.2.4ELISA检测大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平:将大鼠从颈动脉取血4 mL,4 ℃静置1 h,以3500 r/min低温离心10 min,将分离的血清分装到EP管中,-80 ℃冷冻保存。测定时取出血清,快速解冻,分别按照HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA试剂盒说明书严格操作,检测血清中HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.5Western blot法检测大鼠异位子宫内膜组织HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白水平:颈椎脱臼法处死大鼠,剥离异位子宫内膜组织,-80 ℃冷冻保存。待进行实验检测时,取出,快速解冻。在液氮中研磨,使用RIPA试剂盒提取总蛋白,根据BCA试剂盒测定蛋白的浓度,计算上样量。SDS-PAGE凝胶电泳后,半干转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;5%脱脂奶粉封闭1 h;分别加入一抗兔抗HMGB1、兔抗TLR4、兔抗MyD88、兔抗TPRV1、兔抗β-actin(1∶500),4 ℃孵育过夜;加入二抗(1∶5 000),室温孵育1 h。经化学发光法进行检测,Tanon软件拍摄图像并进行半定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠PWT

与Sham组相比,EMs组大鼠PWT明显降低(P<0.05)。与EMs组相比,萝卜硫素低、高剂量组、EP组和TAK-242组大鼠PWT明显升高(P<0.05)。萝卜硫素高剂量组作用效果强于萝卜硫素低剂量组、EP组和TAK-242组。萝卜硫素低剂量组作用效果则弱于EP组和TAK-242组(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠PWT比较Table 1 Comparison of PWT in each n=10)

2.2 各组大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平

与Sham组相比,EMs组大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明显升高(P<0.05)。与EMs组相比,萝卜硫素低、高剂量组、EP组和TAK-242组大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明显降低(P<0.05)。萝卜硫素高剂量作用效果强于萝卜硫素低剂量组、EP组和TAK-242组。萝卜硫素低剂量组效果弱于EP组和TAK-242组,见表2。

表2 各组大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平Table 2 Serum levels of HMGB1, TNF-α, IL-6 and IL-10 in each n=10)

2.3 各组大鼠异位子宫内膜组织HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表达情况

与Sham组相比,EMs组大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表达明显升高(P<0.05)。与EMs组相比,萝卜硫素低、高剂量组、EP组和TAK-242组大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表达明显降低(P<0.05)。萝卜硫素高剂量组作用效果强于萝卜硫素低剂量组、EP组和TAK-242组,萝卜硫素低剂量组效果弱于EP和TAK-242组。见图1,表3。

注:A.Sham组;B.EMs组;C.萝卜硫素低剂量组;D.萝卜硫素高剂量组;E.EP组;F.TAK-242组。Note:A. Sham group; B. EMs group; C. sulforaphane low-dose group;D. sulforaphane high-dose group; E. EP group; F. TAK - 242 group.

表3 各组大鼠异位子宫内膜组织HMGB1、TLR4、MyD88和TRPV1蛋白表达水平Table 3 Protein expression levels of HMGB1, TLR4, MyD88 and TRPV1 in ectopic endometrial tissues of rats in each n=10)

3 讨论

目前对于EMs的发病机制尚未明确,认为可能存在的原因主要有遗传因素、激素分泌失调、炎性反应、氧化应激、免疫失衡等。治疗EMs的方式包括手术和口服药物两种,然而手术容易复发,口服避孕药和孕激素会产生较多副作用。因此,寻找副作用小,且对EMs治疗效果显著的药物是我们应对EMs的一种有效方法。研究表明,EMs病灶中出现较为严重的炎性反应和氧化应激反应、多条信号通路被激活,彼此作用,促进周围神经纤维激活,引起内异症疼痛的发生和发展[5]。

HMGB1是一种具有多种生物学功能的细胞因子,能够帮助维护细胞的正常生理功能,然而它也能诱导炎性反应的发生,促进其他细胞因子的释放,加剧炎性反应的持续时间和程度,同时其也是TLR4的重要内源性配体。TNF-α和IL-6是两种重要的炎性因子,当机体出现炎性反应时,TNF-α和IL-6的分泌量会明显增加,且二者具有较强的致炎性,能够激活信号通路,导致更多炎性介质的分泌,引起组织损伤,加重炎性反应。另外,IL-6还可诱导细胞分泌IL-10,IL-10是机体具有免疫和抗炎功效的细胞因子,当机体出现较强的炎性反应时,为了消除炎性反应,维持机体平衡,TH2细胞会分泌大量的IL-10来抑炎,同时,IL-10又能刺激IL-4和IL-13等抗炎因子的产生,共同发挥调节作用[6]。本研究结果显示,当大鼠出现EMs时,体内HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的水平会明显升高;而萝卜硫素能够明显抑制HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的升高。这提示,萝卜硫素能够通过减少TNF-α等炎性因子产生,来抑制炎性反应。萝卜硫素作用后IL-10水平降低,可能是因为萝卜硫素发挥了抗炎效果,促进炎性反应降低,引起IL-10分泌量减少。

上面提到,HMGB1在释放到胞外后,能够与TLR4受体特异性结合,从而激活下游信号通道,导致炎性介质的大量产生,促进炎症的发生与发展。HMGB1-TLR4通路被激活后,在进一步进行信号传导时,包括了两种传导途径,一种是MyD88依赖性信号途径,一种是MyD88非依赖性途径,两条途径虽然不一致,但最终都会导致下游NF-κB的激活,引起大量包括TNF-α、IL-6在内的炎性介质的产生[7-9]。本研究结果显示,大鼠出现EMs时,HMGB1、TLR4和MyD88蛋白表达会明显增加,而萝卜硫素和EP、TAK-242均能够降低HMGB1、TLR4和MyD88的蛋白表达。这显示,萝卜硫素可能是通过抑制HMGB1-TLR4-MyD88信号通路的激活,减少多种炎性介质的产生与释放,抑制炎性反应的发展,从而减轻对组织的损伤和周围神经纤维的激活。

TRPV1是一种膜通道性受体,在痛觉传递的过程中发挥重要作用。有研究发现,EMs大鼠内膜组织中TRPV1蛋白表达会明显升高,大鼠PWT降低[10]。本研究结果显示,大鼠出现EMs时,TRPV1蛋白表达升高,PWT降低;而萝卜硫素和EP、TAK-242能够明显降低大鼠TRPV1蛋白表达,提高大鼠PWT。结果显示,萝卜硫素可能是通过抑制HMGB1-TLR4-MyD88信号通路,减少TRPV1的激活,来阻断疼痛信号向神经纤维的传递,减轻MEs导致的疼痛。

综上所述,萝卜硫素对大鼠EMs导致的机械性疼痛具有减轻作用,作用机制很可能是抑制了HMGB1-TLR4-MyD88信号通路激活,减少炎性因子及TRPV1的表达。