一种改良小鼠心脏穿刺动脉血采集方法

闫思雨 毕友坤 刘 群 姬广聚 马丽红

(1.北京协和医学院中国医学科学院阜外医院,北京 100037)(2.中国科学院生物物理研究所,北京 100101)

血气分析可通过测定酸碱度(pH)和溶解在血液中的气体(主要指CO2、O2),评价机体呼吸功能与酸碱平衡状态。此时要求采集的血液类型为动脉血,而当其应用的对象为小鼠时,动脉血采集的操作存在一定挑战性。目前常用的小鼠动脉血采集方式有:颈动脉采血、股动脉采血、经皮左心室穿刺采血等[1-4]。经颈动脉采集动脉血需要插管等相关器械的配合,而腹主动脉穿刺由于较大的创伤易引起机体的缺氧反应及酸碱平衡紊乱,因而小鼠动脉血采集最常使用的方式为经左心室穿刺采血。

在麻醉状态下心脏穿刺取血是实验室常用的小动物终末取血方法,也是美国兽医协会批准的小型哺乳动物安乐死技术[1],尤其在需要较大血量的时候,心脏穿刺可提供稳定、大量的血液。其操作方式可由腹腔经隔膜向上刺入左心室,或由胸壁肋骨间隙刺进胸腔直入左心室,但两者均存在难度高、成功率低的问题。该操作的顺利完成需要熟练的穿刺采血技术;同时,小鼠的较小体型、毛发及皮肤的遮盖等因素对心脏定位造成困难;而开胸直刺心脏采血则会由于机械损伤带来的应激及反馈,造成血液成分的急剧变化,影响实验结果。针对上述问题,我们在传统操作方式及既往文献报道的基础上进行改进,建立了一种改良小鼠心脏穿刺动脉血采集方法。

1 材料与方法

1.1 材料

8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠40只,体质量(20.38±1.34)g,健康状况良好,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,生产许可证号【SCXK(京) 2019-0010】。于中国科学院生物物理研究所SPF级动物房饲养,自由饮食,饲料为SPF级小鼠饲料,饮用灭菌水,恒温23～25 ℃,恒湿(55±5)%,采用12 h/12 h昼夜间断照明。实验过程中遵照小动物福利进行,符合相关法规、标准、指南要求。

1.2 方法

1.2.1动物麻醉与固定:用 5% 戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉。待小鼠被麻醉后,以皮肤捏夹及刺激脚趾反应确定小鼠进入深度麻醉状态。将其以仰卧位置于操作板上,并用胶布固定其四肢(图1A),使其身体保持舒展状态,避免躯干扭曲。

注:A.小鼠四肢固定;B.传统心脏穿刺采动脉血;C.改良后心脏穿刺采动脉血。Note: A. Mouse limbs fixed; B. Traditional heart puncture arterial blood collection; C. Improved cardiac puncture for arterial blood collection.

1.2.2心脏穿刺采血:将小鼠按体质量随机分为传统穿刺组和改良穿刺组,每组各20只。操作者分别采用以下两种方法对两组小鼠进行心脏穿刺采血。

传统穿刺组:采用传统心脏穿刺采血方法。一手拇指及食指分别置于小鼠两前肢腋部,向中心轻微挤压以固定心脏位置,另一手持肝素化(0.2 U/mL)的1 mL注射器刺入小鼠心尖搏动处,以小鼠前正中线及双上肢连线交叉点向下向外各0.5 cm左右的位置为刺入点,与小鼠腹侧皮肤呈30～40°的角度斜向上刺入,针尖指向动物头部。当针尖出现回血后缓慢向外拉动注射器,直到采集到足够的血液(图1B)。在采血完成后立即以脱颈法处死小鼠。

改良穿刺组:采用改良心脏穿刺采血方法。以一手持眼科镊夹起剑突部位的表皮,另一手持眼科剪由剑突向上呈V字形剪开小鼠皮肤,将表皮层与肌肉层分离,以止血钳夹取剪开的小鼠表皮边缘,置于小鼠头部上方,暴露小鼠胸腔的肌肉层(图1C)。此时可在小鼠第3～4肋间观察到明显的心脏搏动,一手持肝素化(0.2 U/mL)的1 mL注射器,从左侧肋间直刺左心室,由心尖搏动点斜向上刺入,针尖朝向小鼠头部,见到针头随心脏搏动且有回血则表示针尖已刺入心脏,血液借助心脏搏动力量涌入针管,操作者同时缓慢向外拉动注射器直到采集到足够的血液,采血后立即以脱颈法处死小鼠。

1.2.3血气分析:血气分析的最低检测血量要求约为0.2 mL[5]。因此,将采血成功定义为顺利刺入小鼠心脏且采集到0.2 mL动脉血。为确定改良后的采血方式是否影响血气分析检测结果,我们使用血气分析仪(雅培血气分析仪i-STAT 300-G)对两种方式得到的小鼠动脉血进行血气分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠采血成功率、最大采血量比较

传统穿刺组小鼠的心脏穿刺成功率为40%,最大采血量为(0.41±0.13)mL;改良穿刺组小鼠的穿刺成功率为90%,最大采血量为(0.51±0.10)mL。结果显示,改良方法的成功率及最大采血量均显著高于传统方法,差异具有统计学意义(P<0.01;P<0.05),见表1。

表1 小鼠两种心脏穿刺方法的动脉血采集情况比较Table 1 Comparison of arterial blood collection between two cardiac puncture methods in

2.2 血气分析

传统方法组的酸碱度pH为7.08±0.12,改良方法组的pH为7.09±0.13(t=-0.17,P=0.87);传统方法组的二氧化碳分压(PCO2)为35.60±6.02,改良方法组的PCO2为32.33±4.09(t=1.27,P=0.22);传统方法组的氧分压(PO2)为90.13±10.23,改良方法组的PO2为97.13±14.76(t=-1.10,P=0.29);传统方法组的血氧饱和度(SO2)为87.00±5.29,改良方法组的SO2为91.63±4.41(t=-1.90,P=0.78),以上血气分析结果均未显示出统计学差异,见表2。

表2 小鼠两种心脏穿刺方法的血气分析结果比较Table 2 Comparison of blood gas analysis results of two cardiac puncture methods in

3 讨论

传统的小鼠心脏穿刺采血方法,不论采用由腹腔经隔膜向上刺入心脏或是由胸壁肋骨间隙进入胸腔直刺心脏,均很难准确地一针刺入心室腔内吸取足够血量;而开胸后直刺心脏采血又会由于机械创伤引起血液成分改变。在本实验中,我们对传统的心脏穿刺方法进行了改良,只剪开小鼠表皮而不开胸,在避免对小鼠造成较大损伤的前提下,减少了皮毛滑动及影响视野的问题,增强了小鼠心脏定位的准确性,提高了穿刺的成功率及采血量。因小鼠体型和体质量对采血的成功率和最大采血量影响较大,本研究对两组小鼠的体质量进行了统计分析,排除了这一混杂因素对操作评判的影响。同时,我们对传统心脏穿刺和改良后心脏穿刺采集到的动脉血分别进行了血气分析,两组间的检测结果并无显著差异,且与既往研究的心脏穿刺动脉血气分析数值相近[5]。值得注意的是,改良后采血方式检测出的血氧饱和度在一定程度上呈现出高于传统采血方式的趋势,虽然未有显著的统计学差异,但改良后的采血方式可能通过对小鼠左心的准确定位而避免右心血液的混入,从而提高动脉血的纯度。

一项研究[5]对小鼠动脉血常用的几种采集方法(颈总动脉插管、腹主动脉穿刺、经皮左心室穿刺)进行了比较,结果显示,腹主动脉穿刺最易引起机体的缺氧反应及酸碱平衡紊乱,可能由于较大的创伤易使机体处于应激状态,从而发生电解质、能量代谢、内环境的平衡失调。颈总动脉插管及经皮左心室穿刺相对来说更为稳定,但经皮左心室穿刺的成功率较低,且采集时可能混入静脉血,导致血氧饱和度低于颈总动脉插管。该研究心脏穿刺存在以上问题的主要原因在于隔着皮毛对小鼠进行穿刺操作较难,同时,该研究采用的进针角度是垂直于胸壁,此角度可能造成针头刺入右心室,从而导致采集的动脉血中混有静脉血。本研究则在穿刺采血前需要剪开小鼠表皮,进针方式也改为由小鼠胸壁偏左侧斜向上进针,这就规避了以上问题,大大提高了心脏穿刺采血的成功率,降低了混入静脉血的可能性。考虑到小鼠心脏穿刺采血的操作具有一定难度,多项研究尝试对此进行改进。一项研究[6]通过向小鼠左心室注射肝素达到全身肝素化的效果,继而开胸经右心室取血,此方式避免了开胸对小鼠血液造成高凝状态的影响,同时也增加了采血量。但这一方式只能适用于对血液类型没有明确要求的情况,如果实验明确需要采集动脉血则不能使用。另一项研究[7]在超声引导下进行小鼠心脏穿刺,可提高心脏定位的准确性和最大采血量(1.3～1.6 mL),但这一操作方式不但要求有小动物超声的设备,也要求操作者需要熟练掌握小鼠超声显影,以暴露心室腔切面,方便穿刺的顺利进行,做到超声引导和针头穿刺的良好配合。因此,这一方式虽然有利于操作精准性的提高,但其可行性和实操性依然存在一定困难。本研究对于小鼠心脏穿刺采血技术的改良主要是通过避免小鼠表皮对于操作的影响,从而达到提高穿刺准确性的目的,降低了实验操作人员在心脏穿刺上的技术难度,且不需要特殊的仪器设备支持,易于掌握。

改良后的小鼠心脏穿刺采血技术具有定位准确、操作简单、采血量多的优势。但在实际操作中仍有以下几点需要注意:(1)虽然剪开表皮后小鼠心脏定位较明确,但仍然可能出现难以抽出血液的情况,此时主要考虑刺入心脏的角度和深度问题,可能由于针头刺到小鼠心室壁或刺穿心脏导致无法吸出血液。因此,首先需要做的是调整针刺角度,而非将针头完全拔出。反复对小鼠心脏进行穿刺,不但可能会引起血液由心脏溢出,快速形成凝血团块,也可能会对小鼠胸腔造成其他未知损伤。(2)在注射器的使用方面也有两点需要引起注意,其一是在使用前需要对其进行肝素化的预处理,即使不对小鼠进行开胸处理,抽血时血液接触抽血器具内面,也会在一定程度上激活凝血系统[6,8];其二是在抽血过程中应注意控制速度,当观察到血液随小鼠心跳进入注射器后,保持缓慢匀速地抽取血液。因为快速抽吸容易导致红细胞在注射器针管内过度挤压,引起细胞破裂,进而出现溶血现象。(3)如果需要采集的血液类型为动脉血,则需要注意进针位置应在小鼠胸壁偏左侧,斜向上刺入,针尖朝向小鼠头部。相比于传统的由胸壁上方直刺或是由隔膜向上直刺,此种进针方向更能保证针间刺入左心室,采集到动脉血液。