模拟长期失重对白化与非白化大鼠眼部影响的比较*

危冬昱 穆玉雪 许馨月 苏玉婷 李少衡,3 曹瑞丹 张作明 陈 涛

(1.空军军医大学航空航天医学系航空航天临床医学中心,西安 710032)(2.空军军医大学西京医院空勤科,西安 710032) (3.空军军医大学西京医院眼科,西安 710032)

1956年以来,我国的航天事业蓬勃发展,从顺利发射自主研发的第一颗人造地球卫星“东方红1号”到自主培养的航天员首次进入太空仅用了33年的时间。近期,我国航天员已经在空间站中开展了180 d的航天飞行。值得庆贺的同时也预示未来长期航天飞行工作将是航天员面对的重要任务。航天事业的快速发展给航天医学带来了严峻的挑战。太空失重的环境中,由于全身体液的头向转移,机体各系统均受到不同程度的影响[1]。但由于现实条件限制,研究学者们广泛采取地面尾吊大鼠模型模拟微重力环境下的机体改变[2-4]。良好的视觉功能是宇航员准确获得外界信息并有效完成各项航天任务的重要保障。微重力暴露条件下眼部的改变一直是航天医学的重要研究问题。在前期的实验过程中,通过相应的眼部检测技术,在原有尾吊大鼠模型的基础上,建立了模拟长期失重所致眼损伤Sprague-Dawley(SD)大鼠疾病动物模型[5]。

SD大鼠属于白化大鼠,其虹膜及视网膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)细胞中均不含黑色素,因此在很多眼科疾病的研究中白化大鼠动物模型的应用严重受限。为了完善和补充前期建立的模拟长期微重力暴露所致眼部损伤疾病动物模型的构建方法,有必要在非白化大鼠中进行验证。Brown-Norway大鼠(BN大鼠,非白化)其生命力强,繁殖率高,在实验动物中运用广泛[6]。因此,本实验旨在BN大鼠上验证已建立的模拟长期失重所致眼损伤动物模型构建方法,了解白化与非白化大鼠在模拟长期微重力暴露后眼部损伤是否存在差异,为该模型的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

正常雄性SD大鼠12只,体质量(170±10)g,购自空军军医大学实验动物中心,实验动物生产许可证【SCXK(陕)2019-001】;雄性BN大鼠12只,体质量(170±10)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证【SCXK(京)2016-0011】。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组:SD大鼠随机分为正常对照组(Normal,NS组)与模型组(Model,MS组),每组6只。BN大鼠随机分为正常对照组(Normal,NB组)与模型组(Model,MB组),每组6只。

1.2.2模拟长期失重:MS组与MB组大鼠均按已发表模型方法[5]进行造模,具体方法为:预饲养一周后,将大鼠置于大鼠固定器中,外露其尾部。尾部清洁后,依次用安息香酊和松香酊涂抹并晾干,增加尾部粘合力同时减少尾部损伤。待尾巴稍干后,准备长约20 cm的医用胶带将大鼠尾部吊起,使大鼠始终处于约30°头低位,悬吊于特制的单笼中,时长为8周。悬吊期间大鼠前爪可自由活动,但后爪即使伸直也无法触及笼的触杆,大鼠可在笼中自由进食饮水,SD大鼠与BN大鼠实验动物等级均为SPF级别,动物房内温度控制在(23±1)℃,湿度控制在45%～55%,采用12 h/12 h昼夜间断照明。8周造模结束后进行眼部视觉功能检测,眼底照相,眼球取材并测量大鼠右下肢比目鱼肌质量及体质重。

1.2.3视觉电生理检测:提前12 h对大鼠进行暗适应,在标准暗室红光环境下使用法国迈威视觉电生理检查仪参照ISCEV国际标准进行视觉电生理检测。具体操作步骤如下:常规麻醉(3 mL/kg 1%戊巴比妥钠 + 50 μL 50%速眠新)及复方托比卡胺滴眼液散瞳后,将麻醉好的大鼠置于电生理操作台上固定,滴入1～2滴盐酸奥布卡因滴眼液进行眼球表面麻醉,随后安放电极依次进行视网膜电图(ERG)和视觉诱发电位(VEP)的检测。ERG作用电极(Ag-Cl环状电极)放于角膜上,参考电极(不锈钢针状电极)插入大鼠脸颊皮下,接地电极(不锈钢针状电极)插入大鼠尾部皮下。VEP记录电极均为不锈钢针状电极,作用电极置于两耳连线中心皮下,参考电极和接地电极位置同ERG。ERG结果分析时选用暗适应3.0反应b波幅值、明适应3.0反应b波幅值和OPs 反应的O2波幅值。VEP 反应分析 P2波峰时值和波幅值。

1.2.4眼底照相:ERG检查结束后将大鼠置于升降台上固定,用复方托比卡胺滴眼液散瞳,盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉,摆好眼位,待瞳孔散大后(直径4 mm)将医用透明质酸钠涂于测试眼角膜上,将小动物眼底成像系统(S-5000、CANADA)显微镜镜头对准瞳孔,选用白光模式,调整焦距,待成像清晰后进行拍照。每只大鼠双眼均进行拍照。

1.2.5荧光素钠眼底血管造影:常规眼底照相结束后,为进一步观察BN 大鼠眼底血管有无异常改变,对BN大鼠进行荧光素钠眼底照相,选用蓝光模式,拍照方法同普通眼底照相,将10%浓度的荧光素钠(0.1 mL/200 g)腹腔注射,于注射后1～2 min后采集眼底照片。每只大鼠双眼均进行拍照。拍照完成后用0.9%氯化钠溶液清洗双眼,并用加替沙星凝胶点眼预防感染。

1.2.6视网膜切片HE染色:在活体实验结束后,过量麻药注射处死大鼠,取眼球,于冰上处理眼球周围多余组织,在角膜上用细针扎一小孔,将眼球放于眼球固定液中固定,4°过夜,24 h后取出眼球,进行常规脱水并行石蜡包埋切片后完成HE染色。从视乳头中心开始每间隔500 μm测量一次视网膜外核层厚度,直至距离视乳头3 500 μm处。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 尾部悬吊对两个品系大鼠体质量及比目鱼肌质量的影响

如图1所示,尾部悬吊前及悬吊8周后SD大鼠和BN大鼠的体质量与相应对照组相比无统计学差异(P>0.05),而两个品系的模型组大鼠的比目鱼肌质量与相应对照组相比明显减轻(P<0.01),表明两个品系的大鼠在尾部悬吊模拟失重8周后均出现了失重引起的骨骼肌的萎缩表现。

注:A.尾部悬吊前各组大鼠体质量;B.尾部悬吊8周后各组大鼠体质量;C.尾部悬吊8周后各组大鼠比目鱼肌质量;**P<0.01。Note: A. Comparison of body mass between SD and BN rats before tail suspension; B. Comparison of body weight between SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; C. Soleus muscle mass in SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; **P<0.01.

2.2 尾部悬吊8周对两个品系大鼠视觉功能的影响

如图2,SD大鼠尾部悬吊8周后,视觉功能明显下降,Ns与Ms组相比,暗适应3.0ERG反应b波幅值降低【(997.50±24.53)μVvs. (504.83±52.53)μV,P<0.01】、振荡电位OPS反应O2波幅值降低【(195.00±17.25)μVvs. (70.90±8.56)μV,P<0.01】和明适应3.0ERG反应b波幅值降低【(161.50±7.94)μVvs.(80.67±2.72)μV,P<0.01】,VEP反应P2波幅值无明显改变【(16.08±1.49) μVvs. (15.27±0.84)μV,P>0.05】,但是VEP反应P2波模型组峰时值明显延长【(83.30±1.96)msvs. (113.83±4.07)ms,P<0.01】。而BN大鼠在尾部悬吊8周后,与相应对照组相比视觉功能无明显改变,暗适应3.0ERG反应b波幅值、振荡电位OPS反应O2幅值、明适应3.0ERG反应b波幅值、VEP反应P2幅值和VEP反应P2峰时值均无统计学差异(P>0.05)。

注:A.SD大鼠和BN大鼠ERG和VEP的典型波形图;B.ERG暗适应3.0反应b波幅值统计结果;C.振荡电位Ops反应O2波幅值统计结果;D.ERG明适应3.0反b波幅值统计结果;E.VEP反应P2波峰时值统计结果;F.VEP反应P2波幅值统计结果; **P<0.01。Note: A. Typical waveforms of ERG and VEP in SD and BN rats; B. Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted 3.0 ERG;C. Statistical results of the amplitude of O2 wave of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D. Statistical results of the amplitude of b wave of Light-adapted 3.0 ERG; E. Statistical results of the latency of P2 wave of VEP; F. Statistical results of the amplitude of P2 wave of VEP; **P<0.01.

2.3 尾部悬吊8周对两品系大鼠眼底的影响

尾部悬吊8周时SD大鼠眼底未见明显出血,视乳头水肿等改变,模型组与对照组相比可见脉络膜血流增多现象,尾部悬吊8周时BN大鼠眼底未见明显视乳头水肿、视网膜血管渗漏和脉络膜血流增多现象(图3)。

图3 尾悬吊8周各组大鼠典型眼底图像Fig.3 Typical fundus images of SD and BN rats in control group and model group after tail suspension for 8 weeks

2.4 尾部悬吊8周对两个品系大鼠视网膜结构的影响

SD大鼠尾部悬吊8周后,大鼠视网膜外核层厚度与相应对照组相比明显变薄(P<0.01),表现为视网膜退行性改变;而BN大鼠在尾部悬吊8周后,大鼠视网膜各层厚度与相应对照组相比无统计学差异(图4)。

2.5 荧光素钠眼底血管造影

尾部悬吊8周时,BN大鼠视网膜、脉络膜血管未见渗漏等异常改变(图5)。

图5 尾部悬吊8 周BN大鼠荧光素钠眼底血管造影Fig.5 FFA of BN rat after tail suspension for 8 weeks

3 讨论

以往的研究[5]表明,SD大鼠在尾部悬吊模拟失重8周后可以出现以视网膜外核层变薄为特征的视网膜退行性改变。本实验中也观察到SD大鼠在尾部悬吊8周后视网膜的功能和结构均发生了退行性改变,再次证实了尾部悬吊模拟失重导致眼部损伤SD大鼠模型的有效性。但是,本实验同时也观察到BN大鼠在尾部悬吊模拟失重8周后,虽然骨骼肌已经出现了失重引起的萎缩效应(图1),但是视网膜的结构(图4,5)和功能(图2)并未发生退行性改变。

SD大鼠与BN大鼠均属于常用的封闭群实验大鼠,这两种品系大鼠眼部表型中最大的区别在于RPE细胞中是否含有黑色素。RPE细胞是位于视网膜光感受器底层的单层色素上皮细胞,RPE的主要功能是将营养物质和生长因子从脉络膜毛细血管转运至光感受器上,起到血眼屏障的作用,吞噬视网膜代谢终产物、消化光感受器外节膜盘并生成新的膜盘,从而保证光感受器的正常功能,促进损伤后的再生和修复[7-8]。RPE功能的异常可导致视网膜色素变性、光感受细胞死亡,最终导致眼部疾病。RPE细胞中的黑色素对其周边结构有重要的保护作用,它可吸纳光感受细胞无法吸收的多余光,保护视网膜免受光产生的氧活性物质的影响。RPE中的黑色素颗粒在光照条件下对RPE和视网膜神经细胞都具有重要保护作用。同时,RPE黑色素参与眼内多种生理作用,参与视网膜和神经发育、抗光损伤等。有研究[8]表明,在同样的光照条件下,电子显微镜显示白化小鼠较非白化小鼠因缺少黑色素,视网膜外节和外核层明显变薄,RPE结构异常,脉络膜血管明显萎缩。这些均说明RPE细胞中的黑色素颗粒在对抗眼内视网膜损伤过程中,发挥了重要的作用[9-10]。据此,推测两个品系大鼠在尾部悬吊模拟失重后眼部不同的表现可能与RPE中的黑色素含量有关。

综上所述,在利用尾部悬吊模拟失重所致眼部损伤研究时,宜选用白化大鼠进行造模,而不应选择非白化的色素大鼠。本研究在以往建立的模拟长期失重所致眼损伤大鼠疾病动物模型的基础上对构建方法进行必要的补充。此外,本研究也提示我们RPE中的黑色素可能是研究长期失重所致眼部损伤干预措施的重要靶点,为航天相关眼病的研究提供了新思路。