比较5种消毒剂对4种细菌的杀菌效果

刘志国 董 浩 刘铭赫 李林娇 马丽颖

(1.中国食品药品检定研究院,北京 102629)(2. 中国兽医药品监察所,北京 100081)

实验动物设施按照洁净度,可以分为普通环境设施、屏障环境设施和隔离环境设施。其中,屏障环境设施和隔离环境设施对病原微生物都有着严格的控制要求。根据国家标准《实验动物 环境及设施》(GB 14925—2010)的相关要求,屏障环境设施的空气洁净度要达到7级,饲养无菌动物和免疫缺陷动物的隔离环境设施的空气洁净度更是要达到5级。

致病性微生物一旦侵入屏障环境设施和隔离环境设施,可能引起实验动物的感染、发病,干扰动物实验结果,甚至威胁工作人员身体健康等一系列不良后果。做好日常消毒工作是保障实验动物设施洁净度的重要手段之一[1]。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌是SPF级小鼠、大鼠、豚鼠和兔均必须排除的细菌性病原。为了研究目前常用的新洁尔灭消毒液、健之素消毒泡腾片、百毒杀消毒液、百胜-30(碘酸混合溶液3.0%)、75%乙醇等5种消毒剂对于上述病原微生物的杀灭效果,参考国家标准《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020)设计了相应的实验方案进行了消毒剂杀菌效果的实验验证。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株:金黄色葡萄球菌(CVCC4098)、铜绿假单胞菌(CVCC2000)、肺炎克雷伯菌(CVCC4079)和鼠伤寒沙门氏菌(CVCC2220)均购自中国兽医药品监察所。

1.1.2试剂与耗材:新洁尔灭消毒液【消毒液原液的苯扎溴铵含量为2.7%～3.3%(W/V)】(山东安捷高科消毒科技有限公司);健之素消毒泡腾片(北京长江脉医药科技有限责任公司),有效氯含量为(35.0±3.5)%;百毒杀消毒液(癸甲溴铵溶液,规格为100 mL∶10 g)(上海派斯德生化有限公司);百胜-30(碘酸混合溶液3.0%)由Evans生产厂生产,成分为醇乙氧基化物20%～25%,硫酸5%～10%,磷酸5%～10%,碘1%～3%;75%乙醇(北京鸿志伟达工贸有限公司);胰酪大豆胨液体培养基(Trypticase Soy Broth,TSB)、D/E中和肉汤培养基和吐温80(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1工作浓度消毒剂的配置:百毒杀消毒液:25 μL的百毒杀原液加入15 mL蒸馏水中,即将百毒杀原液进行600倍稀释;健之素消毒液:1片健之素泡腾片(250 mg)加入500 mL蒸馏水中,混匀;新洁尔灭消毒液:按照使用说明将新洁尔灭消毒液原液与蒸馏水按照1∶4的比例混合;75%乙醇:直接使用产品原液;百胜-30消毒液:将100 μL百胜-30消毒液原液加入10 mL的蒸馏水中,配置成1%浓度的溶液;1∶200稀释百毒杀消毒液:50 μL的百毒杀原液加入10 mL蒸馏水中;1∶100稀释百毒杀消毒液:100 μL的百毒杀原液加入10 mL蒸馏水中。

1.2.2菌悬液的制备:将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌划线接种于胰酪大豆胨固体培养基,37 ℃温箱过夜培养。挑取菌落形态正常的单菌落,接种于10 mL TSB液体培养基中,置于37 ℃摇床中,200 r/min振荡培养12 h。使用无菌0.9%氯化钠溶液对细菌进行倍比稀释并计数。将各组细菌的浓度统一稀释至1×109CFU/mL。

1.2.3中和剂鉴定实验:为了验证D/E中和肉汤培养基针对每种消毒剂中和效果,参考《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020),略有改动。依次分成两个实验组进行验证。实验组1(对照组)为0.4 mL无菌0.9%氯化钠溶液与4.5 mL的D/E中和肉汤培养基混匀,室温孵育5 min后,加入0.1 mL的菌悬液,混匀后静置10 min,随后进行细菌计数。实验组2(中和组)为0.4 mL消毒液与4.5 mL的D/E中和肉汤培养基混匀,室温孵育5 min后,加入0.1 mL的菌悬液,混匀后静置10 min,随后进行细菌计数。同时对所使用的0.9%氯化钠溶液和D/E中和肉汤培养基各取200 μL进行涂板,验证其未被细菌污染。

1.2.4悬液定量杀菌实验:取0.3 mL的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌悬液分别加入1.2 mL工作浓度的百毒杀消毒液、健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、百胜-30消毒液和75%乙醇中,混匀后室温孵育1.5、5、10和30 min。随后,分别取出0.5 mL的上述混合液加入4.5 mL的D/E中和肉汤培养基,并进行充分混匀。室温放置10 min后,进行细菌计数。上述实验重复3次。

1.2.5结果判定:参考《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020)进行中和剂的中和效果及消毒剂的杀菌效果判定。在中和剂与稀释液无菌验证成立的前提下,两组之间细菌计数菌落数误差率<15%,则证明中和剂有效。悬液定量杀灭实验中,指定时间内消毒液各次重复的杀灭对数值均≥5.00,证明杀菌效果合格,否则判定为不合格。

2 结果

2.1 D/E中和肉汤培养基中和效果的鉴定

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌培养12 h后稀释至1×109CFU/mL,测试D/E中和肉汤培养基对工作浓度的百毒杀消毒液、健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、百胜-30消毒液和75%乙醇的中和效果。根据《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020)的要求,对照组与中和组之间的菌落数偏差均小于15%,说明D/E中和肉汤培养基对于上述5种消毒液均有良好的中和效果。

2.2 不同消毒液对金黄色葡萄球菌的杀菌效果

测试5种消毒液在室温下对金黄色葡萄球菌的杀菌效果,如表1所示。除了百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)外的其他4种消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,经过16～24 h培养,培养基上没有任何菌落生长。考虑到细菌在加入消毒液和加入中和剂后共被稀释了50倍,所以当平板无细菌生长时表明经过消毒的细菌浓度小于2.5×102CFU/mL。此时,杀菌对数也大于5,说明这4种消毒剂可以在1.5 min有效杀灭金黄色葡萄球菌。

表1 各种消毒液对金黄色葡萄球菌的杀菌效果Table 1 The bactericidal effect of various disinfectants on Staphylococcus aureus

百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)在1.5 min和5 min两个时间点均无法完全杀灭金黄色葡萄球菌,杀菌对数也小于5,说明在5 min内百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)无法有效杀灭金黄色葡萄球菌。

2.3 不同消毒液对绿脓杆菌的杀菌效果

测试5种消毒液在室温下对铜绿假单胞菌的杀菌效果,如表2所示。健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、百胜-30消毒液和75%乙醇4种消毒液在作用1.5、5、10和30 min后取200 μL涂板,经过16～24 h培养,培养基上没有任何菌落生长,说明此时细菌的浓度小于2.5×102CFU/mL。此时,杀菌对数也大于5,说明这4种消毒剂可以在1.5 min有效杀灭绿脓杆菌。

表2 各种消毒液对铜绿假单胞菌的杀菌效果Table 2 The bactericidal effect of various disinfectants on Pseudomonas aeruginosa

百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)在作用30 min内无法完全杀灭铜绿假单胞菌,1.5、5、10和30 min各个时间点的杀菌对数均小于5,说明该稀释浓度下的百毒杀消毒液对铜绿假单胞菌的消毒效果不理想。

2.4 不同消毒液对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果

测试5种消毒液在室温下对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果,如表3所示。健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、百胜-30消毒液和75%乙醇4种消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,经过16～24 h培养,培养基上没有任何菌落生长,说明此时细菌的浓度小于2.5×102CFU/mL。此时,杀菌对数也大于5,说明这4种消毒剂可以在1.5 min有效杀灭鼠伤寒沙门氏菌。

表3 各种消毒液对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果Table 3 The bactericidal effect of various disinfectants on Salmonella typhimurium

百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)在1.5 min无法完全杀灭鼠伤寒沙门氏菌,杀菌对数小于5,说明在1.5 min百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)无法有效杀灭鼠伤寒沙门氏菌。

2.5 不同消毒液对肺炎克雷伯菌的杀菌效果

测试5种消毒液在室温下对肺炎克雷伯菌的杀菌效果,如表4所示。健之素消毒液、新洁尔灭消毒液、百胜-30消毒液和75%乙醇4种消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,经过16～24 h培养,培养基上没有任何菌落生长,说明此时细菌的浓度小于2.5×102CFU/mL。此时,杀菌对数也大于5,说明这4种消毒剂可以在1.5 min有效杀灭肺炎克雷伯菌。

表4 各种消毒液对肺炎克雷伯菌的杀菌效果Table 4 The bactericidal effect of various disinfectants on Klebsiella pneumoniae

百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)在1.5 min无法完全杀灭肺炎克雷伯菌,杀菌对数小于5,说明在1.5 min百毒杀消毒液(1∶600倍稀释)无法有效杀灭肺炎克雷伯菌。

2.6 不同浓度百毒杀消毒液对铜绿假单胞菌的杀菌效果

为了测试是否高浓度的百毒杀消毒液对绿脓杆菌具有较好的杀灭效果,分别配置了1∶100倍稀释和1∶200倍稀释的百毒杀消毒液,与1×109CFU/mL在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,经过16～24 h培养。结果如表5所示,提高百毒杀的浓度后,对于绿脓杆菌的杀灭效果有明显提升。尽管1∶200倍稀释和1∶100倍稀释的百毒杀在1.5 min内不能完全杀灭铜绿假单胞菌,但是杀菌对数均已经大于5,符合《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020)的要求。

表5 不同浓度百毒杀消毒液对铜绿假单胞菌的杀菌效果Table 5 The bactericidal effect of different concentrations of Didecyl dimethyl ammonium bromide solution on Pseudomonas aeruginosa

3 讨论

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌是SPF级小鼠、大鼠、豚鼠和兔均必须排除的细菌性病原。在前期的研究表明,这4种细菌在SPF级实验动物中均有一定比例的流行,其中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在实验动物中的检出率较高。在2011—2017年的145份SPF级大鼠的回盲内容物中金黄色葡萄球菌的检出率达到21.38%[2]。2008—2017年在北京地区实验大鼠中检测到金黄色葡萄球菌165株,阳性率为8.44%[3]。2008—2011年对北京地区实验动物绿脓杆菌的检测发现,小鼠、大鼠、豚鼠和兔的检出率为6.6%～9.7%[4]。

正确的开展实验动物设施的消毒工作,是有效控制病原微生物滋生的重要手段。目前可供选择的消毒剂种类繁多,如按照化学性质分类,可以分为卤化物类消毒剂、过氧化物类消毒剂、季铵盐类消毒剂、醇类消毒剂、醛类消毒剂、酚类消毒剂等[1]。在前期的研究中,对于实验动物设施中消毒剂的选择也已经有不少的文献报道,但是大多数文献都专注于介绍了消毒剂的种类、性质、作用机制、毒性以及对模式菌株的杀菌效果[1,5-8]。

不同类型消毒剂针对特定的SPF级实验动物必须排除病原的消毒效果的研究比较有限。抑菌环实验研究发现0.1%的新洁尔灭、有效氯含量为0.4%的84消毒液、0.4%浓度的洗必泰对沙门氏菌具有完全抑制作用[9]。有抑菌环实验研究了6种常用消毒剂对沙门氏菌和大肠埃希菌的杀灭效果,发现0.05%古迪安对沙门氏菌和大肠埃希菌的抑菌作用效果最好,其次是0.05%百毒杀和0.25%戊二醛溶液,0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉和0.25%新洁尔灭抑菌效果较差[10]。有研究采用了薄膜过滤法验证了0.2%新洁尔灭和5%甲酚皂消毒液可以有效杀灭金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉[11]。本研究采用的是《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T 38502—2020)中的悬液定量杀菌实验进行消毒剂的杀灭效果评价,由于在测试过程中使用了中和剂对消毒剂进行即时中和,所以可以比较精确地确定不同消毒剂在特定浓度下杀灭细菌的最短时间。在本研究中,健之素消毒液(500 mg/L)、新洁尔灭消毒液(含0.54%～0.66%苯扎溴铵)、1%的百胜-30消毒液和75%乙醇4种消毒液均可以在1.5 min将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌进行有效杀灭。1∶600倍稀释的百毒杀无法在1.5 min内对上述4种细菌进行有效杀灭,需要延长消毒作用的时间。而对于铜绿假单胞菌,1∶600倍稀释百毒杀的杀灭效果较差,当百毒杀浓度提高至1∶200和1∶100倍稀释后,才可以有效杀灭绿脓杆菌,因此建议在屏障设施的日常消毒过程中,使用1∶200倍稀释浓度的百毒杀进行消毒。

值得注意的是,由于评价消毒剂效果的不同研究中采用的评价方法并不相同,细菌浓度、消毒液工作浓度、是否使用中和剂、细菌与消毒液作用比例和作用时间等细节上也有出入,所以不同研究的实验结果可能出现一定的不一致性。在后续研究中,有必要采用不同的评价方法对消毒剂的杀菌效果进行平行验证。

本研究测试了5种消毒剂对4种SPF级实验动物必须排除的细菌的消毒效果,为实验动物设施内消毒剂的选择,以及日常消毒剂使用效果评价,提供了一定的数据参考。