不同周期的高脂血症大鼠模型的相关指标变化分析*

侯红平 张广平 彭 博 魏晓露 王丽芳 宋 玲 高云航 陈腾飞 宁良菊

(1.中国中医科学院中药研究所,北京 100700)(2.四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室,成都 610041)

高脂血症是一种常见的血脂代谢异常的疾病,血脂异常通常与三酰甘油(triglyceride,TG)和胆固醇(cholesterol,CHO)增高密切相关。二者虽然可以通过生化检测等方法快速便捷地得到,但是血脂异常对身体的损害往往不容易被发现,且存在一定程度的忽视[1]。由于血脂异常的损伤持续存在,对身体各种组织和细胞持续造成威胁,随着血脂水平的不断升高,其损伤程度也会不断加重,造成机体代谢紊乱[2],进而产生动脉粥样硬化[3]、肾功能不全[4]、高血压[5]等一系列严重危害人类健康的并发症。因此,积极地预防和治疗高脂血症的发生和发展是一项艰巨的任务。

目前,高脂血症动物模型的制作方法有很多种,但最常用的还是高脂饲料喂养大鼠来制备。大鼠遗传背景明确、价格低廉、方便饲养、血液和组织容易获得,在脂质代谢的研究中是一种应用较为广泛的实验动物。但是,在制作模型的过程中,我们发现,大鼠高脂血症的周期不明确,有的为4周,有的为6周,有的为8周,同时模型制备过程中血脂水平的表达变化有待商榷[6-8]。为此,本研究通过高脂饲料喂养大鼠,通过设置不同实验周期,检测各组动物的血脂水平和氧化应激水平,科学地分析和探讨不同周期高血脂症大鼠的血脂变化及其规律,为后续研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:SD大鼠,雄性,60只,5～6周龄,体质量150～170 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证号【SCXK(京)2016-0011】。饲养于中国中医科学院中药研究所实验动物屏障环境(SPF级)中,使用许可证号【SYXK(京)2019-0003】。所有实验操作均按照中药研究所动物伦理委员会的批准,伦理审批号:2021B125-1。

1.1.2主要试剂和仪器:高速冷冻离心机(Sigma公司,型号:3-18KS);全自动生化分析仪(佳能集团,型号:TBA-120FR)。

甘油三酯试剂盒,胆固醇试剂盒,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL),低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL),天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST),丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT),丙二醛(malondialdehyde, MDA),均购于北京索莱宝科技有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒,总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)检测试剂盒,均购于碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组:所有动物在检疫1 d,适应5 d后,按体质量随机分为对照组和处理组,两组别再分为0,15,30,60 和90 d 5个小组,每组6只。对照组正常摄食饮水,处理组正常饮水,但给予高脂饲料(基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.2%胆固醇+0.2%胆酸钠)喂养,每天观察余料,不够时及时补充饲料,连续喂养90 d。实验期间,每周称一次动物体质量,同时观察动物的饮食情况、外观、活动状况等。

1.2.2处理动物及检测指标:在0,15,30,60和90 d不同时间节点分别处理动物。处理前动物禁食约16 h后,48 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,肝称重,部分肝组织置于4%多聚甲醛中,进行HE病理染色观察。血清3 000 r/min 离心15 min后,采用全自动生化仪检测血脂水平和肝代谢指标。部分肺组织匀浆后,3 000 r/min 离心15 min取上清,BCA检测蛋白浓度,采用全自动生化仪检测血脂水平和肝代谢指标。同时利用试剂盒检测血清中的氧化应激指标,具体操作详见说明书。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同周期大鼠的一般状态观察

对照组不同时间节点的动物均能自主活动,精神状态良好,毛色有光泽,二便正常。处理组大鼠造模开始初期,体质量增长明显,但15 d后,出现饮食减少,体质量增长有所降低的趋势,分析认为与高脂饲料饮食密切相关。但30 d后,上述情况有所缓解,排便量增加,被毛暗淡无光泽,出现脱毛、行动迟缓的状态,上述情况一直持续到90 d。

2.2 不同周期大鼠的体质量及肝系数

对照组不同时间节点的动物体质量持续增加,肝系数基本在2 g/100 g左右。而处理组动物体质量自15 d增长较为明显,直到90 d体质量与同时期的对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。处理组动物的肝系数自30 d开始明显增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示处理组的肝组织自30 d出现水肿等病变(表1)。

表1 不同周期大鼠体质量及肝系数Table 1 Body mass and liver coefficient of rats

2.3 不同周期大鼠血清中血脂相关指标和生化指标的表达

与同周期的对照组相比,处理组30 和60 d TG明显的升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但90 d的TG 与对照组相比,差异并无统计学意义;处理组30 和60 d CHO明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),90 d的CHO有所降低,但与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);处理组15、30、60和90 d的LDL较对照组有所升高,差异具有统计学意义(P<0.05);处理组60 和90 d的HDL、AST和ALT较对照组有所升高,差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 不同周期大鼠血清中血脂相关指标和生化指标的表达Table 2 Expression of blood lipid-related indexes and biochemical indexes in serum of rats in different cycles

2.4 不同周期大鼠组织中血脂相关指标和生化指标的表达

与对照组相比,处理组的TG、LDL在15 d即明显升高,CHO、HDL、AST和ALT在30 d明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 不同周期大鼠组织中血脂相关指标和生化指标Table 3 Blood lipid-related indexes and biochemical indexes in rat tissues of different

2.5 不同周期大鼠血清中氧化应激指标

对照组不同周期大鼠的血清中MDA含量逐渐升高,SOD和T-AOC有所降低,但并未达到统计学差异,分析认为与动物衰老的氧化损伤逐渐增强相关。而处理组动物,自15 d开始MDA处理升高,SOD明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。T-AOC自30 d开始明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 不同周期大鼠血清中氧化应激指标的表达Table 4 Expression of oxidative stress indexes in serum of rats in different

2.6 肝病理学观察

HE组织病理染色显示,对照组动物的肝组织自0 到90 d结果正常,肝窦清晰可见,细胞形态饱满正常,细胞核和细胞质均正常。而处理组动物的肝组织自15 d开始,淋巴细胞聚集,肝细胞肿胀变性,细胞核挤向一侧,直到90 d肝索排列紊乱,肝细胞肿胀,发生脂肪变性,胞质内有大小不等的空泡肝血窦受压变形等病理改变(图1)。

注:A. 对照组(0 d),B. 对照组(90 d),C. 处理组(15 d),D. 处理组(30 d),E. 处理组(60 d),F. 处理组(90 d)。Note:A.Control group (0 d), B.Control group (90 d), C.treatment group (15 d), D.treatment group (30 d), E.treatment group (60 d),F.treatment group (90 d).

3 讨论

混合型高脂饲料喂养是最常见的高脂血症模型,操作较为方便,成模率也较高。本研究中混合高脂饲料除了常规的基础饲料外,含有15%猪油、20%蔗糖、1.2%胆固醇和0.2%胆酸钠。猪油主要含有饱和高级脂肪酸甘油酯,能够影响甘油三酯的水平,补充体内脂肪,促进TG和TC的生成[9]。蔗糖在体内能够转化后,以糖原或脂肪的形式贮存在体内,能够促进体内各种血脂成分的生成。胆固醇主要影响血清中T-CHO和LDL的水平。胆酸钠能够促进大户对胆固醇和脂肪的吸收,造成脂代谢紊乱,迫使动物迅速形成高脂血症。在动物血清中,TC的水平主要受胆固醇的影响,TG水平则有猪油的比例密切相关[10]。在我们的高脂血症模型中,高脂饲料喂养30 d后,大鼠血清中的TG、TC和LDL出现不同程度的升高,提示造模的成功。

但造模90 d后,血清中TC和TG却出现明显的下降,TG与对照组相比,差异不具有统计学意义(P>0.05)。但经肝组织匀浆后检测血脂水平发现,肝组织中的TC和TG升高较为明显,且与对照组相比,差异具有学意义(P<0.05)。有文献报道[11],也提出了血清中TG低于对照组的情况。高脂饲料喂养的大鼠血脂水平在体内呈现“升高-适应-升高”的模式。有研究[12]发现,添加胆固醇喂养的大鼠体内,胆固醇合成的关键酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A 还 原 酶的活性下降,同时增加胆固醇值的合成,促使胆固醇值优先向极低密度脂蛋白内填充,导致肝外转移的TG减少,造成血液中TG降低、肝中TG蓄积。这也间接证明了高脂血症模型脂质代谢的紊乱和复杂性。基于上次发现和深层次的原因,建议高脂血症动物模型在30 d后,除了血清中血脂水平的检测,同时增加肝组织中血脂水平,肝代谢水平以及氧化应激指标等多方面的检测指标,以便更科学、全面的说明问题。

高脂血症模型是个周期较长的代谢性疾病。在我们的前期研究中,同时比较了雌鼠在喂养高脂饲养后的血脂水平变化,发现与雄性相差甚大,故未展现在本研究中。专门比较雄雌大鼠喂养高脂饲料后血脂的代谢变化,发现雄性大鼠表现为体质量增加合并典型的高胆固醇血症(II a 型),而雌性大鼠主要表现为体质量减低合并混合型高脂血症(II b 型)[13]。因此,在今后的研究与分析中,应注重雄性和雌性动物在此方面的差异。

综上,高脂血症动物模型成模率较高,但在药物预防和治疗作用的研究与分析中,应考虑到代谢的变化和周期的长短,除了血清指标外,建议增加组织和其他代谢酶活性的检测指标,更科学地分析药物的作用。