兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

董 浩 李 楠 许中衎 邢壮壮 王学文 刘铭赫 李林姣 范学政 马丽颖

(1.中国食品药品检定研究院,北京 102629)(2. 中国兽医药品监察所,北京 100081)

泰泽病(Tyzzer’s disease)是由泰泽病原体(毛样芽孢杆菌,Clostridiumpiliforme)感染引起的一种潜伏期长、发病迅速、致死率高的传染病。1917年Tyzzer在日本舞蹈小鼠 (Japanese waltzing mice)身上首次发现了该病。该病原的宿主广泛,目前已发现兔、大鼠、仓鼠、麝鼠、猫、犬、郊狼、马及罗猴等多种动物可以被感染[1-3]。在我国,已有多篇关于兔、大鼠和小鼠感染泰泽病原体的报道[4-7]。值得注意的是,有文献报道泰泽病原体具有感染人的可能性,从产前妇女和实验动物饲养人员的血清样本中均检测到了泰泽病原体的阳性抗体[4,8]。

对于SPF级实验兔来说,泰泽病原体也是其必须排除的病原之一。由于泰泽病原体不能在无细胞的体外培养基中进行培养,使得难以获得该病原的纯培养物,因此只能使用感染泰泽病原体动物组织样品制备血清学实验所需的抗原或抗体,这无疑会对血清学检测方法的特异性造成一定的影响。同时,血清学检测方法对窗口期或者隐性感染的动物进行检测时,常会出现假阴性结果。除此之外,有研究者认为泰泽病原体与梭菌属的细菌之间存在一定的交叉反应,因此建议ELISA、IFA这类检测病原抗体的方法最好只用于泰泽病原体感染初步筛查,其确诊还需要采用血清学以外的检测方法进一步检测、验证[9]。

由于泰泽病原体主要以隐性感染的形式存在于易感动物体内,这无疑是对尽早发现和剔除感染动物带来了一定的困难。考虑到粪口途径是泰泽病原体在动物之间自然传播的主要方式,本研究拟以兔的粪球作为检测样本,建立一种实时荧光PCR检测方法,应用于兔泰泽病原体的快速检测。

1 材料和方法

1.1 样品和菌种来源

布鲁菌病S2疫苗株的基因组和35株魏氏梭菌临床分离株均由国家动物布鲁菌病参考实验室惠赠。多杀巴氏杆菌(CVCC 1676)、鼠伤寒沙门菌(CVCC 2220)、金黄色葡萄球菌(CVCC 4098)、绿脓杆菌(CVCC 2000)和肺炎克雷伯菌(CVCC 4079)均购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心。70份家兔的粪球样品采自某普通级兔饲养机构。

1.2 主要试剂与仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒(西安天隆科技有限公司);GoTag Probe qPCR Master Mix(Promega公司);质粒提取试剂盒(Omega公司);TE缓冲液(北京索莱宝科技有限公司);GeneRotex全自动旋转式核酸提取仪(西安天隆科技有限公司);NanoDrop2000【赛默飞世尔科技(中国)有限公司】;Roche LightCycler480 II 实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。

1.3 实验方法

1.3.1前期文献数据的验证根据参考文献[10]报道的泰泽病原体nested-PCR检测方法,合成相应的引物序列(TZ-1、TZ-2、TZ-3和TZ-4)并进行了10份普通级实验兔的粪球样品的检测。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,并使用Blast数据库进行比对。

1.3.2引物探针的设计与合成:根据1.3.1的验证实验结果,针对泰泽病原体特异性的196 bp 16S rRNA序列,采用Primer-BLAST在线软件设计了1对特异性引物(TZ-F和TZ-R)和1条TaqMan 探针(TZ-Probe),用于泰泽病原体的检测。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物和探针序列详见表1。

表1 引物和探针列表Table 1 List of primers and probes

1.3.3质粒标准品的制备:根据参考文献[10]中提供的泰泽病原体特异性的196 bp 16S rRNA序列,由武汉金开瑞生物工程有限公司合成了含有上述序列的质粒标准品(pUC-TZ196)。将含有pUC-TZ196阳性质粒的感受态细胞,培养至稳定期后,使用质粒提取试剂盒提取质粒pUC-TZ196。利用Nanodrop2000测定质粒的浓度,并按照公式拷贝数=(6.02×1023×浓度)/(碱基数×660)×10-9,换算质粒拷贝数。使用TE缓冲液对质粒标准品进行适当稀释。

1.3.4实时荧光PCR反应条件的优化:用矩阵法进行实时荧光PCR扩增,筛选引物和探针的搭配浓度,以获得最佳的扩增效果。

1.3.5实时荧光PCR特异性实验:分别以SPF级实验兔必须排除的多杀巴氏杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯菌等灭活细菌核酸以及布鲁菌病S2疫苗株的基因组为模板进行实时荧光PCR 检测,并设置1个pUC-TZ196质粒标准品阳性对照和1个空白对照(水)。

由于泰泽病原体的196 bp 16S rRNA序列在Blast数据库中比对显示该序列与部分梭菌属的细菌同源性较高,因此使用建立的实时荧光PCR方法对35株魏氏梭菌临床分离株进行了检测,并设置1个pUC-TZ196质粒标准品阳性对照和1个空白对照(水)。

1.3.6实时荧光PCR标准曲线的绘制:将合成的pUC-TZ196质粒标准品,使用TE缓冲液进行10倍梯度稀释,模板浓度为3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104和3.2×103copies/μL的质粒标准品,进行实时荧光PCR检测,用Roche LightCycler480 II 实时荧光定量PCR仪配套软件绘制标准曲线。

1.3.7实时荧光PCR敏感性实验:将合成的pUC-TZ196质粒标准品使用TE缓冲液进行梯度稀释,模板为浓度3.2×106、3.2×105、3.2×104、3.2×103、3.2×102、3.2×101和3.2×100copies/μL的质粒标准品,进行实时荧光PCR扩增。在确定可以获得S型标准曲线的最低模板浓度后,再使用TE缓冲液以2的倍数进行梯度稀释,每个稀释度做6个重复,进行实时荧光PCR检测,以6个重复样品均可以获得S型特异性扩增曲线的最低质粒标准品浓度作为实时荧光PCR方法的最低检测限。

1.3.8重复性实验:分别采用浓度为3.2×106和3.2×104copies/μL的质粒标准品进行实时荧光PCR实验,每个浓度的模板分别进行了批内重复3次和批间重复3次实验,以评估建立方法的重复性。

1.3.9临床样品检测:采用建立的实时荧光PCR法,对70份普通级实验兔的粪球样品进行检测。同时,已报道的泰泽病原体nested-PCR检测方法对上述样品进行检测。

2 结果

2.1 前期文献数据的验证

采用已报道的泰泽病原体nested-PCR检测方法对10份普通级实验兔的粪球样品的检测。结果显示,10份粪球样品的nested-PCR产物中4份扩增出196 bp的目的片段。切取2份比较清晰的目的条带胶块,送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果通过Blast数据库比对显示与毛样芽孢杆菌(Clostridiumpiliforme)的同源性最高,由于只使用正向引物进行测序,所以最高的一致性为95.71%(图1)。上述结果说明,扩增获得196 bp产物为泰泽病原体的核酸。

图1 套式PCR产物测序的Blast比对结果Fig.1 Blast results of sequencing of nested-PCR product

2.2 实时荧光PCR反应条件的优化结果

通过体系优化,实时荧光PCR的最佳反应体系为20 μL:GoTaq® Probe qPCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.9 μL,10 μmol/L 的探针0.6 μL,DNA 模板 2 μL,加入无核酸酶的水补齐 20 μL。反应程序确定为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,52 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,45个循环。每个循环第2步,72 ℃ 20 s,收集FAM荧光信号。

2.3 标准曲线的建立

提取pUC-TZ196质粒标准品,换算拷贝数后进行10倍倍比稀释后作为模板,采用优化好反应条件的实时荧光PCR进行扩增。实验结果显示,在使用3.2×107～3.2×103copies/μL的质粒标准品作为模板时,泰泽病原体实时荧光PCR的扩增效率Efficiency为1.908,斜率Slope为-3.565(图2)。

注:1～5: 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 和3.2×103 copies/μL的质粒标准品的扩增曲线。Note:1-5:the amplification curves of 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 and 3.2×103 copies/μL plasmid standard.

2.4 特异性实验

分别以SPF级实验兔必须排除的多杀巴氏杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯菌等灭活细菌核酸以及布鲁菌病S2疫苗株和35株魏氏梭菌临床分离株的基因组为模板进行实时荧光PCR 检测,同时以ddH2O为阴性对照,进行实时荧光PCR扩增。实验结果显示,只有pUC-TZ196质粒标准品阳性对照可以产生S型扩增曲线,其他细菌均未出现明显扩增(图3)。这说明该方法的特异性良好。

图3 实时荧光PCR的特异性实验Fig.3 Specificity test for the real-time PCR

2.5 敏感性实验

为了测试实时荧光PCR的最低检测限,将pUC-TZ196质粒标准品阳性对照分别进行10倍倍比稀释后作为模板,采用优化好的实时荧光PCR进行扩增。实验结果显示,3.2×101copies/μL质粒标准品扩增可以获得S型扩增曲线,而3.2×100copies/μL质粒标准品无S型扩增曲线产生。进一步将3.2×101copies/μL质粒标准品使用TE缓冲液进行2倍倍比稀释,每个浓度做6次重复使用,结果表明当质粒标准品稀释至8 copies/μL时,6个重复样品均可以获得S型扩增曲线,当稀释至4 copies/μL时,仅1个重复样品可以获得S型扩增曲线,说明建立的实时荧光PCR方法的最低检测限为8 copies/μL。

2.6 重复性实验

为了测试实时荧光PCR的重复性,分别采用浓度为3.2×106,3.2×104copies/μL的两种质粒标准品进行了批内重复和批间重复实验。结果如表2所示,批内和批间的变异系数均小于3%。这说明建立的实时荧光PCR具有良好的重复性。

表2 实时荧光PCR的批内和批间重复实验Table 2 In-batch and inter-batch replications of real-time PCR

2.7 临床样品检测

利用建立的实时荧光PCR对采自某家兔饲养机构的70份粪球样品进行检测。结果表明,70份家兔粪球样品,实时荧光检出59阳性,套式PCR检测出55份阳性,实时荧光PCR比套式PCR多检出了4份阳性样品,两种方法的符合率为94.29%。

3 讨论

由于无法进行泰泽病原体的体外纯培养,所以在NCBI数据库中依然没有该病原的基因组全序列,这无疑是给泰泽病原体的分子生物学检测方法的建立带来了困难。2003年,我国的研究者们曾经报道了泰泽病原体的基因组DNA提取方法,但是未见后续基因组学方面的研究数据[11]。目前,在泰泽病原体的分子检测方法中,主要是以其16S rRNA中的特异性196 bp序列作为检测靶标[12-13]。

通过对该196 bp序列的blast比对分析,发现其与某些梭菌属的细菌以及金黄色葡萄球菌具有较高的同源性,因此本研究中使用了35株魏氏梭菌临床分离株和金黄色葡萄球菌对建立的实时荧光PCR方法进行了特异性的检测,结果发现该方法特异性良好,不与上述菌株发生交叉反应。

与参考文献[10]建立的套式PCR相比,本研究中建立实时荧光PCR检测方法极大的简化了实验操作的流程,不仅减少了一次加样过程,还省去了电泳的操作流程,使得检测环节从约4 h缩短至仅1 h,节省了大量的人力和时间。与参考文献[12]建立的反向斑点杂交方法相比,实时荧光PCR方法在操作简便性和检测的高通量性方面也是具有较大的优势,更利于在各种检测实验室中进行推广。

从本研究中检测的70份临床样品的阳性比例来看,在该兔的饲养群中,泰泽病原体感染比较严重。根据与该兔饲养机构的饲养人员沟通,该兔群近期未发生腹泻和突然死亡病例,这也说明在兔中泰泽病原体也是可以长期隐性感染而不发病的。

综上所述,本研究建立了一种可以用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR方法,其有比较理想的敏感性、特异性和重复性,对于临床样品检测效果也明显优于已报道的套式PCR方法。因此,该方法可用于兔的泰泽病原体的核酸检测,对提升我国兔泰泽病原体检测能力具有较大意义。