多糖类免疫增强剂在鱼类养殖中的应用研究进展

李蕾，蒋昕彧，朱雷，孔祥会

（河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007）

近年来，随着高密度集约化养殖的大规模推广应用，养殖水环境持续恶化，水产养殖动物抵御病原入侵的能力下降、疾病频发，造成重大经济损失[1]。目前应对病害常用的措施是药物防控，而频繁使用抗生素后，细菌基因突变产生耐药基因，改变自身的代谢途径，产生耐药菌等问题，降低了水产品质量，影响人类健康[2]。药物防控的诸多弊端使免疫防控逐渐成为水产养殖的重要议题。

免疫增强剂（Immunostimulants）是指具有促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质[3]。水产养殖中，常用多糖、白细胞介素（Interleukin，IL）、维生素E、CpG 寡脱氧核苷酸等生物活性物质作免疫增强剂[4-6]。

多糖（Polysaccharide）是一类从细菌、真菌和动植物等生物中提取获得，由10 个以上单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。生产中，常将具有生物活性，能激活机体参与抵御病原微生物入侵，增强免疫应答能力的多糖称作免疫增强剂。它能增加抗体效价，增强白细胞和巨噬细胞的吞噬能力，提高淋巴细胞转化率，发挥抵御病原入侵和增强机体免疫应答的功能[4,5]。目前，多糖类免疫增强剂的研究受到广泛关注，广泛应用在鱼类养殖中。根据来源，免疫增强剂可分为植物来源、微生物来源和动物来源3 类（表1）[6]。

表1 各种多糖免疫增强剂对鱼类免疫功能的影响Tab.1 Effects of various polysaccharide immunoenhancers on immune function of Fish

1 植物来源的多糖

天然植物多糖属于植物体内一类重要的生物大分子，包含多种活性成分，可作为天然免疫调节剂。在饲料中添加植物多糖可以促进鱼类生长，调节免疫力，预防病原微生物感染[7]，与抗生素相比，具有无耐药性和无残留等优点[8]。

1.1 黄芪多糖

黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是从黄芪中分离纯化得到的多糖。它的单糖为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖[9]。APS 具有调节肠道菌群、提高动物抗氧化能力、调控炎症反应、维持细胞稳态、增强免疫功能等作用[9,10]。草鱼（Ctenopharyngodon idella）饲料中添加APS 可以提高超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性进，提高抗氧化能力；可以调节肠道微生物的多样性，激活免疫相关基因表达，保护鱼体免受病原菌感染。SOD 和CAT 是细胞抗氧化系统中的两个中心酶，多糖能显著提高二者的活性，具有明显的抗氧化效果，保护鱼体免受氧化损伤。多糖进入肠道后，被肠道微生物利用，产生代谢产物，改变肠道菌群结构，减少病原体的增殖[12]。鲫（Carassius auratus）饲料中添加不同浓度的APS 可调节先天免疫能力，提高鲫抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的能力和成活率，促进生长，但超过100 mg/kg 并不能进一步提高鱼体生长发育和先天免疫力[13]。刘金海等[14]发现，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）摄食不同剂量的APS 后，血液中白细胞吞噬活性、溶菌酶（LZ）活性、过氧化物酶活性、酸/碱性磷酸酶活性和抗体含量显著增强和增加，较佳添加剂量为600 mg/kg。大菱鲆（Scophthalmus maximus）摄食含150 mg/kg APS 的饲料，可显著提高鱼体生长性能和抗氧化活性，还可以调控Toll 样受体（TLRs）如TLR5α、5β、8、21 以及MyD88 和NF-κB p65 的基因表达。这些基因在TLRs/NF-κB 信号通路中起着至关重要的信号转导作用。APS 可激活TLRs/NF-κB 信号通路中关键细胞因子来调节免疫应答[15]。Zhang 等[16]采用薄膜分散超声法制备了黄芪多糖脂质体（Astragalus polysaccharide liposome，APSL），发现APS 和APSL 在体内外均能提高大黄鱼（Larimichthys crocea）非特异性免疫酶活性和抗氧化能力，增强头肾巨噬细胞的M1 巨噬细胞的典型特征——NO 生成和吞噬活性，显著上调促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α）、IFN-γ 和iNOS 的表达水平。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，添加多糖后巨噬细胞经历经典或替代激活，分化为M1 或M2 巨噬细胞。M1 巨噬细胞以诱导呼吸爆发、产生促炎细胞因子和合成诱导型一氧化氮合酶（iNOS），来参与消除病原体和引发炎症。APSL 的效果明显优于APS，可作为APS 的潜在药物载体。孙林浩等[17]研究发现，APS 可以抑制大黄鱼头肾巨噬细胞经丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）诱导后的呼吸爆发活性，增强经脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬细胞的吞噬活性，提高巨噬细胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因的表达量，调节巨噬细胞免疫能力。Yu 等[18]研究发现，添加0.10%的APS 是促进尖吻鲈（Lates calcarifer）生长性能和抗哈维氏弧菌能力的最适水平，但0.20%实验组的生长性能显著下降，过量添加APS 对鱼体不利。上述研究得出，APS 的适宜剂量范围为0.005%～0.200%。

1.2 枸杞多糖

从枸杞中提取的水溶性枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）一般由6 种单糖（半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和木糖）和18种氨基酸组成。它们的结构是β-葡聚糖，（1→6）-β-半乳糖基残基的骨架与生物功能相关[19]。LBP可通过增强T 细胞介导的免疫反应和体液免疫反应，提高机体免疫力[20]。LBP 能提高鲳鲹（Trachinotus ovatus）抗氧化能力和固有免疫能力，适宜添加量为0.10%[21]。在饲料中添加LBP，通过激活巨噬细胞，促进脾组织中IL-1β 基因的表达，提升了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长速率，增强了补体C3 活性。补体是血液中一组具有酶活性的蛋白质系列，通过调节吞噬、呼吸爆发、趋化和细胞裂解等在免疫中发挥关键作用[22]。在饲料中添加0.5～2.0 g/kg LBP 可以显著提高杂交石斑鱼肝脏抗氧化酶活性以及免疫相关基因表达，调控肝脏的炎症反应，抑制细胞凋亡，改善杂交石斑鱼的生长性能和饲料利用率[23]。Mo 等[24]在草鱼和尼罗罗非鱼饲料中添加2.0 g/kg 和20 g/kg 的LBP，发现2.0 g/kg 显著提高了抗蛋白酶活性、血清总免疫球蛋白和血清杀菌活性、生长性能和成活率，是合适选择。根据以上研究得出，LBP 的适宜添加剂量范围为0.05%～2.00%。

1.3 玉屏风多糖

玉屏风多糖（Yu-Ping-Feng polysaccharides，YPF-P）是由黄芪、白术和防风三味中草药按2∶2∶1 重量比组成的复合中草药多糖。尹福泉等[25]研究发现，YPF-P 可以通过改善草鱼肠道黏膜的形态来提高草鱼肠道的吸收功能，还可通过提高头肾IL-2 和IFN-γ 基因的表达增强鱼体免疫力，其最适添加量为1.6 g/kg。杨虹等[26]用YPF-P 复合益生菌饲喂乌鳢（Channa argus），提高了乌鳢的肠绒毛高度、降低了隐窝深度以及增加肌层厚度，保证肠道形态结构的完整性，还显著提高了溶菌酶（LZM）和SOD 的活性。YPF-P 可以提高草鱼生长性能，促进免疫器官发育，通过提高肝胰脏中SOD 和CAT 活力来提高鱼体抗氧化能力，较适添加剂量为1.6 g/kg，而添加量达到2.0 g/kg 时，与对照组相比，肝胰脏中SOD、CAT 活力下降，抗氧化能力减弱，即添加量超过一定的范围就会对机体产生不良影响[27]。根据以上研究得出，YPF-P 的适宜添加剂量范围为0.08%～0.20%。

1.4 海藻多糖

海藻多糖（Seaweed polysaccharide）具有广泛的生物活性，包括促进鱼体生长、调节免疫、抑制炎症细胞和提高抗氧化能力等[28]。从大团扇藻（Padina gymnospora）中提取多糖饲喂鲤，不同剂量均能显著提高鲤血清溶菌酶、髓过氧化物酶活性，上调鲤IL-1β 和C 型溶菌酶等免疫相关基因的表达，保护鱼体免受嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌的感染[29]。鲫饲料中分别添加4%的4 种海藻（浒苔Enteromorpha prolifera、条斑紫菜Porphyra yezoensis、铜藻Sargassum horneri 和坛紫菜Porphyra haitanensis）多糖，均可刺激机体免疫器官发育，浒苔组可显著提高碱性磷酸酶和血清中球蛋白总含量，提高抵抗病毒能力，浒苔组和铜藻组可显著提高抗嗜水气单胞菌感染能力[30]。Zhou 等[31]研究发现，40 g/kg 的浒苔多糖可促进鲫的生长，提高肠道消化酶活性和血清中SOD 和LYZ 等酶的活性，增强对嗜水气单胞菌的抵能力。从刺松藻（Codium fragile）中提取硫酸化多糖饲喂石斑鱼，0.1%的多糖可增强石斑鱼的免疫水平，抵御迟缓爱德华氏菌的感染[32]。3 g/kg 的条斑紫菜多糖可以显著提高草鱼生长性能和补体C3/C4 活性，减少细菌或病毒感染[33]。Marian等[34]从石莼（Ulva ohnoi）中提取硫酸化多糖，腹腔注射塞内加尔鳎（Solea senegalensis），能通过替代和经典的补体途径来激活、调节补体，显著上调趋化因子、蛋白酶体和抗原呈递相关的基因表达，诱导急性期蛋白、抗菌肽和补体系统相关基因的表达，以维持机体的动态平衡，防止感染病原后宿主细胞的损伤。以上研究表明，海藻多糖能有效提高鱼体生长性能和免疫能力，改善水生动物的健康状况，在水产养殖中具有较大的应用前景，适宜添加剂量范围为0.01%～8.00%。

1.5 其他植物多糖

还有一些其他植物多糖广泛应用在水产养殖中。无花果（Ficus carica）、板蓝根（Radix isatidis）和五味子（Schisandra chinensis）多糖均可以显著提高鲫溶菌酶活性，激活补体系统，增强机体对嗜水气单胞菌的抵抗力[35]。大鳞鲃（Luciobarbus capito）饲料中添加不同剂量的地黄多糖（Radix rehmanniae Preparata polysaccharides），可以显著上调肠道、肾脏和脾中促炎细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α 和IFN-γ的表达，下调抑炎细胞因子IL-10 和TGF-β 的表达，提高鱼体对嗜水气单胞菌的抵抗能力，其中以0.2%效果最好。促炎细胞因子表达水平是炎症反应是否发生的指标，上调即参与炎症反应，抗炎细胞因子是免疫系统中具有多效性作用的调节性细胞因子，不仅抑制过度的细胞因子释放，还控制炎症过程[36]。当归多糖能提高鲳鲹和点带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）肝脏中超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力，激活补体系统，提高鱼体免疫力[37,38]。

2 微生物来源的多糖

微生物多糖是细菌、真菌或蓝藻等微生物代谢产生的一类代谢中间产物。微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质，如生产周期短，不受地理环境、气候和其他自然条件等因素影响。微生物多糖主要有葡聚糖、脂多糖和真菌多糖等，具有抗菌、抗氧化和调节免疫能力等功能[39]。

2.1 葡聚糖

葡聚糖（Glucans）是一种高分子葡萄糖聚合物。其中，β-葡聚糖是目前最受关注的葡聚糖。β-葡聚糖是由D-吡喃葡糖残基组成的β-连接的多糖，可从蘑菇、酵母、燕麦、大麦、海藻、藻类、真菌和细菌细胞壁中提取[40]。然而，β-葡聚糖的结构多样，来自微生物的β-葡聚糖主要由β（1,3）连接的葡萄糖和几个β（1,6）连接的分支构成，而来自植物的β-葡聚糖主要由β（1,3）和β（1,4）组成，没有分支。来自酵母的β-（1,3/1,6）-葡聚糖常被用作免疫增强剂。β-葡聚糖通过与其特定受体Dectin-1 结合来激活免疫细胞，Dectin-1 是一种表达在巨噬细胞表面的c 型凝集素受体，β-葡聚糖/Dectin-1 复合体通过与TLR2 及其信号通路联合而激活巨噬细胞，通过分泌TNF-α 而引起促炎反应[41]。酵母细胞壁中提取的β（1,3/1,6）-葡聚糖可以通过提高细鳞肥脂鲤（Piaractus mesopotamicus）白细胞的呼吸活性和溶菌酶水平来应对嗜水气单胞菌的感染[42]。Wei 等[39]将酵母菌β（1,3/1,6）-葡聚糖作为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）灭活疫苗佐剂免疫石斑鱼后，鱼体脾脏IgM、MHC-Iα、TNF-α、IL-1β 和IL-16 的表达水平明显升高，血液中的抗体效价、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性提高，相对免疫保护率达（68.0±5.7）%。IgM是一种通用抗体，是硬骨鱼特异性体液免疫反应的唯一组成部分，MHC-Iα 负责呈递结合的外源多肽，并与参与细胞免疫的T 细胞受体特异性相互作用。IL-1β、IL-16和TNF-α 在启动促炎细胞因子级联、巨噬细胞招募和激活以及刺激适应性免疫反应中起重要作用。Lee 等[43]将β-葡聚糖和土霉素混合饲喂石斑鱼，发现混合使用比单独使用一种物质可更好地抵抗细菌感染。葡聚糖的适宜添加剂量范围为0.05%～0.80%。

2.2 脂多糖

脂多糖（LPS）是一种典型的病原体相关分子模式（PAMP），位于革兰氏阴性菌外膜的外层，由三种不同的结构组成：类脂A、核心寡糖和O-抗原。脂A 部分是一种基于氨基葡萄糖的磷脂，具有内毒素的性质，通过识别哺乳动物的模式识别受体（PRRs）来激活先天性免疫反应[44]。小剂量的LPS 可能通过激活补体替代途径、巨噬细胞的吞噬活性以及B 和T 淋巴细胞的增殖等方式提高鱼体先天免疫水平[45]。给巴丁鱼（Pangasianodon hypophthalmus）注射3 mg/kg 的LPS，提高了补体活性和抗体效价，增强了先天免疫应答及对迟缓爱德华氏菌的抵抗力[46]。在巴塔野鲮（Labeo bata）饲料中添加100 mg/kg 的LPS，不仅可以提高血液学参数（总红细胞计数、总白细胞计数、总血清蛋白、白蛋白和球蛋白）、固有免疫参数（呼吸爆发、血清溶菌酶、髓过氧化物酶和血清杀菌活性）和免疫基因表达（C3、β-2 微球蛋白、溶菌酶、转铁蛋白、IFN-1、IFN-γ），还能提高迟缓爱德华氏菌感染后的存活率[47]。脂多糖的适宜添加剂量范围为0.005%～0.015%。

2.3 真菌多糖

真菌多糖广泛存在于真菌的细胞壁中，是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物，具有复杂的生物学活性和功能，其中最主要的是免疫调节活性。目前研究比较多的真菌多糖主要包括香菇多糖（Lentinan，LNT）、灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP）和双孢蘑菇多糖（Agaricus bisporus polysaccharides，ABP）等。480 mg/kg 的香菇多糖饲喂欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）可促进鱼体生长，降低血清转氨酶活性和肝脏丙二醛含量，改善肝脏健康状况[48]。饲料中添加灵芝多糖，可促进罗非鱼（Oreochromis sp.）的生长，显著增强抗氧化酶活性，提高鱼体免疫力[49]。Liu 等[50]用灵芝多糖孵育四氯化碳处理过的鲤肝细胞，可以抑制肝细胞脂质过氧化、提高抗氧化酶活性、抑制细胞凋亡和调节炎症反应，减轻肝细胞炎症反应的损伤。在草鱼饲料中添加1 mg/kg 的双孢蘑菇多糖后，抗嗜水气单胞菌能力、抗氧化能力和适应性免疫应答能力更强，炎症相关基因的表达水平受到显著调控[51]。真菌多糖的适宜添加剂量范围为0.000 1%～0.480 0%。

3 动物来源的多糖

动物多糖常存在于动物的组织和器官中，可改善水产动物机体的生长性能，提高免疫能力[52]。目前广泛应用于水产中的动物多糖主要是甲壳素和壳聚糖。

3.1 甲壳素

甲壳素（Chitin）又称为甲壳质、几丁质，化学名称是（1,4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是自然界中合成量仅次于纤维素的第二大可再生自然资源，是广泛存在于甲壳类的多糖物质，具有无毒、可生物降解和生物相容性等优点[53]。将0.2%甲壳素添加到饲料中投喂），显著增强了卡特拉鲃（Catla catla）头肾细胞中超氧阴离子和NO 的产生，提高白细胞髓过氧化物酶含量和血清溶菌酶活性[54]。南亚黑鲮（Labeo rohita）饲料中添加1%甲壳素，饲喂2 周后抗氧化能力显著提高，同时增强抵御单殖吸虫感染的能力。甲壳素可以通过与其受体之间的相互作用，调节鱼类的免疫功能，还可在肠道环境中降解为壳聚糖，调节微生物群，保护鱼体[55]。1.0 g/kg 的N-乙酰-D-氨基葡萄糖负载甲壳素纳米粒作为尼罗罗非鱼饲料添加剂，提高了罗非鱼的生长速率、总成活率，增强了中性粒细胞呼吸爆发和溶菌酶活性，增强了尼罗罗非鱼的抗病能力[56]。甲壳素的适宜添加剂量范围为0.025%～2.000%。

3.2 壳聚糖

壳聚糖（Chitosan，CS）是甲壳素脱乙酰化衍生物，化学结构是β-（1,4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。壳聚糖在体内的免疫刺激作用可能归因于其氨基部分，促进各种炎症细胞的功能，如巨噬细胞和多形核白细胞，以及不同的细胞因子，来促进鱼体生长、抵抗病毒感染和增强免疫应答[57]。草鱼饲料中添加5 g/kg 的壳聚糖，可以显著提高血清溶菌酶、SOD 活性、AKP 活性、补体C3 含量和血液白细胞吞噬活性，从而增强鱼体的免疫能力[58]。100 μg壳聚糖作为传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）灭活疫苗的佐剂，可以诱导鳜（Siniperca chuatsi）脾和肾中免疫细胞因子的表达，抑制病毒的复制来提高抗病毒能力[59]。用0.05 g/kg 的壳聚糖和纳米壳聚糖负载斜发沸石（Clinoptilolite）饲喂，提高了虹鳟（Oncorhynchus myk iss）生长性能、血清生化参数和消化酶活性，增强了免疫应答能力[60]。壳聚糖的适宜添加剂量范围为0.005%～10%。

4 小结和展望

我国的多糖资源丰富，活性多糖具有无污染、无药物残留以及病原菌不易产生耐药性等优点，能增强机体免疫功能而无毒副作用，符合绿色健康养殖模式。多糖不仅可以提高水产养殖动物抗病力、存活率和促进生长，与疫苗混合使用还能作为佐剂，增强疫苗的抗原效价和作用时效，应用前景十分广阔。然而，多糖免疫增强剂在生产中的应用仍存在一些问题：（1）多糖的结构特征与生物活性之间密切相关。多糖分子结构复杂、多样，与生物活性之间的相关性还有待研究[61]；（2）多糖的作用效果与给药方式有关。注射法引起的免疫反应快，但持续时间短，容易使机体产生应激反应；口服法鱼体受到的应激性刺激较小，但病鱼不摄食时，口服法不能实施；（3）多糖的投喂剂量、频次以及投喂时间直接影响多糖的应用效果。有些免疫增强剂在高剂量下，不仅不会增强免疫效果，反而还会抑制免疫反应，合适的多糖添加量才能促进鱼类的免疫力。多糖的投喂时间和周期对鱼体增强免疫效果非常关键，有的多糖在鱼体发病前使用，而有的则是在鱼体感染后使用。总之，多糖的理化性质、结构特征、使用方法、剂量和期限以及对鱼类免疫的影响较为复杂多样，如何科学合理地使用多糖仍需进一步深入研究。