大口黑鲈杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性分析

郭文杰，韩锐，许为镇，李言伟，但学明

（华南农业大学海洋学院，广东 广州 510665）

大口黑鲈（Micropterus salmoides）俗名加州鲈鱼，肉质坚实，味道鲜美，无肌间刺，已被市场广泛接受，成为了养殖量增长速度最快的水产品之一。2020 年我国大口黑鲈的养殖产量已达16 万余吨[2]，其中广东省的养殖量占全国的75%，池塘养殖面积超过2 666.67 hm2，主要集中在佛山市顺德区和南海区，成为了佛山市水产养殖的支柱种类，形成了苗种、饲料、养殖、加工流通一体化较为完善的产业链。

杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是胞内寄生的革兰氏阴性菌，可溶血，靠周生鞭毛运动[3]。它能感染多种海、淡水鱼类，包括大菱鲆（Scophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）和斑点叉尾（Ictalurus punctatus）[4，5]等，是对水产危害巨大的致病菌。

随着大口黑鲈养殖规模和养殖密度不断扩增，疾病危害也日趋严重。目前对大口黑鲈养殖造成危害的常见病原菌包括柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）以及嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等，这些病原菌通常在每年3—4 月份水温上升到24 ℃以上就开始大量繁殖，如果水环境恶化或鱼体免疫力下降[6]，就会侵染鱼体发病。抗生素的过度使用以及配伍不合理[7]，不但起不到治疗作用，更会引起环境耐药性和抗生素残留等问题[8]。2022 年3 月下旬，广东珠三角地区的大口黑鲈大规模死亡，特别是佛山市南海区沙头镇和九江镇发病最严重，死亡率最高可达50%，且有向周围养殖区域漫延的趋势，患病鱼主要临床症状表现为腹部膨大，严重腹水和内脏缺血。为揭示大口黑鲈死亡原因，本文在佛山市南海区沙头镇9 口鱼塘采集濒死病鱼共42 个病样，进行病理分析、病原分离与鉴定、病原菌毒力和耐药性检测等实验，以期为该病的诊断和防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2022 年3 月16 日—21 日在佛山市南海区沙头镇采集的患病濒死的大口黑鲈体长25～35 cm，典型的临床症状为腹部膨大和内脏缺血。

血平板、BHI 脑心浸液培养基、革兰氏染色试剂盒和细菌生化鉴定试剂盒均购于广东环凯微生物科技有限公司，药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 购自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 病理组织切片观察

取具有典型临床症状病鱼的肝、脾、肾用波恩氏液固定24 h，然后进行常规石蜡切片和HE 染色，对病鱼组织进行病理学分析。

1.2.2 细菌的分离、纯化和鉴定

取具有典型临床症状的病鱼进行拍照记录分析。解剖刀在酒精灯外焰烧红刀口后贴到内脏表面，消除表面细菌，然后用接种环轻轻插入肝脾肾内部，待接种环表面浸润内脏组织液后拔出，在血平板上按照肝、脾、肾分区域进行平板划线。分离完毕后将血平板倒置于28 ℃恒温培养箱。培养48～72 h，观察平板生长结果。挑选形态一致的菌落至BHI固体培养基划线培养两代，获得纯化的菌株。将纯化后的菌株在液体培养基中扩大培养后，加入40%甘油溶液中-80 ℃保存备用。

以过夜培养的菌液为模板，细菌16S rDNA 通用扩增序列为引物（27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R: 5-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3'）进行PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,送华大基因公司测序。将目标菌株的16S rRNA 基因序列在NCBI 数据库中应用BLAST 软件进行同源性分析，用Clustal W 软件将NCBI 数据库中获得的相似度较高的序列和其他种属的序列进行多序列匹配,采用MEGA 6.0 中的邻接法构建系统发育树，并通过自举分析检测置信度，自举数据集为1 000 次。

按照广东环凯微生物科技有限公司细菌生化鉴定试剂盒说明书，将适量新鲜菌液悬液加入20种生化鉴定管中，37 ℃静置，24 h 内观察生化鉴定管中变化。

1.2.3 动物回归试验

试验鱼体长（25±8）cm、体质量（400±124）g，每组10 尾鱼，每尾鱼注射200 μL 菌液。根据吸光值和平板计数结果，制成浓度为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL 的菌悬液进行腹腔注射攻毒，以PBS 为对照组。水温在26 ℃，持续充气，连续观察10 d，记录死亡数量，并分离死鱼肝脾肾的细菌。

1.2.4 药敏试验

选用6 种水产养殖中常用的抗菌药物：四环素、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、利福平和阿莫西林。纯化后的优势菌用无菌水配制成菌悬液后，吸取100 μL 菌悬液（经平板计数CFU 为5.5x108）均匀涂布在BHI 固体培养基上，然后用无菌镊子将药敏纸片轻轻贴合在培养基表面，分布均匀，贴合后将平板倒置，在28 ℃的恒温培养箱中培养24 h后，测量药敏圈直径。根据产品说明书提供的判断标准，得出各药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 病鱼的临床症状

发病池塘水温23 ℃，发病鱼多为体长30～40 cm 的一龄鱼，其中怀卵的雌鱼占比约70%。病鱼体表无明显出血或溃烂，腹部明显膨大，泄殖孔红肿。将鱼体垂直提起，可见少量腹水从泄殖孔中流出（图1）。剖检发现，鳃缺血，肝脏肿大、呈土黄色，脾脏呈暗黑色，后肾明显肿胀，腹腔中存在大量腹水，腹水中有鸡蛋清样凝结物（图2）。

图1 患病大口黑鲈体表症状（黄色圈为腹部明显膨大，红色箭头为泄殖孔红肿）Fig.1 Body surface symptoms of diseased largemouth bass [the abdomen is obviously enlarged（yellow circle）and the genital pore is red in color and swollen（red arrows）]

图2 病鱼鳃（红色箭头）和肝脏缺血、肿大（黄色箭头），腹水严重，含鸡蛋清样凝聚物（黄色圈）Fig.2 Gills（red arrows）and liver（yellow arrows）ischemia of the diseased fish,liver enlargement,severe ascites,containing egg white condensates（yellow circle）

2.2 病理变化

病鱼肝组织坏死，细胞质中有嗜酸性玻璃样小滴，部分肝脏细胞出现空泡变性和脂肪变性。肾小球增生，毛细血管扩张，肾小囊腔变窄，肾小管上皮细胞坏死，肾间组织炎性细胞浸润。脾脏细胞萎缩变性，部分组织坏死（图3）。

图3 病理组织切片Fig.3 Pathological tissue section

2.3 细菌的分离和纯化

大口黑鲈的肝、脾、肾组织在血平板划线培养48 h 后，可见乳白色表面光滑的单菌落，单菌落直径2～3 mm，γ 溶血。从血平板挑取优势单菌落至BHI 固体培养基中纯化培养，36 h 后在平板上形成形态一致的单菌落（图4）。纯化细菌经革兰氏染色后呈阴性，短杆状，其大小约0.5 μm×2 μm，可运动。

图4 用血平板分离的菌落和用BHI 固体培养基纯化的菌落Fig.4 Colonies isolated by blood plate and purified by BHI medium

2.4 分离菌的分子生物学鉴定

把分离菌16s rRNA 的测序结果导入NCBI 的GenBank 数据库中进行BLAST 分析，发现该菌与杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）有100%的同源性。使用MEGA 6.0 软件采用邻接法构建的系统发育树显示（图5），该菌株（S1）与杀鱼爱德华氏菌聚为一支。

图5 基于16S rRNA 基因序列的系统进化发育树Fig.5 Phylogenetic development tree based on 16S rRNA gene sequence

2.5 分离菌的生化鉴定

菌株S1 在生化鉴定实验中，与精氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、葡萄糖发酵、柠檬酸盐以及H2S 的反应中呈现阳性，其余15 项生化鉴定指标均呈现阴性（表1）。结合分子生物学鉴定结果，证实该菌为杀鱼爱德华氏菌。

表1 菌株的理化特性Tab.1 Physicochemical characteristics of the strain

2.6 动物回归感染试验

用不同剂量的细菌腹腔注射健康大口黑鲈72 h 内，三个实验组均出现了死鱼，108、107和106CFU/mL 组死亡率分别为90%、60%和20%，PBS 对照组无死亡（图6）。多数濒死鱼的临床症状与自然发病鱼一致，且可从发病鱼肝脾肾组织中分离出形态一致的优势菌，经16S rRNA 鉴定，均为杀鱼爱德华氏菌。这表明杀鱼爱德华氏菌是大口黑鲈死亡的致病菌。

图6 菌株S1 的回归感染实验Fig.6 Regression infection experiment of strain S1

2.7 药敏试验

对病鱼中分离的杀鱼爱德华氏菌（S1、S3、S4、S8）的药敏试验结果显示，不同鱼塘病鱼的分离细菌的药敏结果不同。1 号塘菌株S1 和8 号塘菌株S8 对氟苯尼考敏感性最强，阿莫西林次之，对多西环素和恩诺沙星中等敏感。而3 号塘菌株S3 和4号塘菌株S4 对阿莫西林最敏感，多西环素次之，对恩诺沙星和氟苯尼考中度敏感。4 株不同塘口的菌株都对利福平和四环素都耐受（表2）。

表2 菌株药敏结果Tab.2 Drug sensitivity results of bacterial strains

3 讨论

本研究在3 月开春季节走访佛山水产养殖基地，跟踪调查加州鲈流行病学。将患病加州鲈采样解剖，从内脏分离出优势病原菌，并对其进行16S rRNA 序列分析和生理生化鉴定，确定优势菌株为加州鲈杀鱼爱德华氏菌。

回归实验结果表明，腹腔注射108CFU/mL 组死亡率为90%，表明分离纯化的杀鱼爱德华氏菌株S1具有很强的致病力，是引起加州鲈在开春水温回暖季节大量死亡的主要病原菌。人工感染菌株S1 的加州鲈出现内脏出血和腹部膨大等与自然感染一致的症状，表明杀鱼爱德华氏菌作为条件性致病菌在适当的水温环境下容易引起加州鲈的急性败血症。但人工感染的加州鲈未出现肝脏脂肪化、缺血、肿大的病症，原因是肝脏的健康主要与养殖投喂模式及环境因素有关，属于长期积累的病理变化结果。过量投喂增加了肝脏的负荷，养殖密度的不断增加也进一步恶化水质环境，导致加州鲈机体免疫水平下降，在病原菌入侵时容易造成大量死亡。

药敏实验中采用了6 种水产动物常用的抗菌药物。结果发现，不同塘口分离的杀鱼爱德华氏菌菌株，对不同药物的敏感度有所差别。四株分离株都对利福平和四环素耐受，1 号和8 号池分离株对氟苯尼考的敏感程度最高，但3、4 号池分离株对阿莫西林药敏度最高。造成这种差异现象主要和不同塘口的用药史有关[9,10]。用药记录显示，3、4 号池存在过量使用氟苯尼考连续拌料投喂的现象。由于抗生素的选择缺乏针对性、种类单一、配伍不合理甚至出现禁忌，不但增加环境中细菌对广谱抗生素的耐药性[11]，也会出现用药效果不佳、抗生素残留[12]等问题。因此，在养殖发病过程中，应先对患病鱼体解剖检查，综合分析近期养殖环境变化、摄食和发病情况，找出疾病根源，结合池塘养殖过程中的用药史，在药敏实验结果的指导下，选出合适的药物及搭配方式，提高用药准确率和成功率，对药物的选择和治疗疗程有明确的规划，做到科学合理用药。

杀鱼爱德华氏菌是在开春水温上升季节引起死亡的最主要病原菌，每年给加州鲈养殖业造成了较大的损失。本研究从患病加州鲈分离出的杀鱼爱德华氏菌毒力也很高，应当引起足够重视。本研究为该病的分离鉴定、药物治疗提供了科学依据，为加州鲈养殖提供了参考。