HPLC法测定夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量

2024-01-08黄志云孙维广李启燕陈斌万安凤高建胜

中国民族民间医药·下半月 2023年10期

关键词：破壁夏枯草籽油

黄志云孙维广李启燕陈斌万安凤高建胜

基金项目：

作者简介：

黄志云（1990—），女，汉族，硕士，主管中药师，研究方向为中药质量控制研究工作。E-mail： zyh2179@163.com

通信作者：

孙维广（1974—），男，汉族，博士，制药高级工程师，研究方向为中药质量控制研究工作。E-mail： sunwg2233@163.com

【摘要】

目的：建立夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸含量测定方法。方法：采用HPLC法，Ultimate XB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温为25℃，检测波长为330nm，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（18∶16∶66），流速1.0mL/min。结果：迷迭香酸线性范围为0.20～1.23μg（R2＝0.9993）；夏枯草籽和夏枯草籽油样品中迷迭香酸的平均回收率分别为99.22%（RSD为1.70%）、100.15%（RSD为2.04%）。结论：该方法操作简单，可靠，重复性好，可用于夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量测定。

【关键词】

夏枯草籽；夏枯草籽油；含量测定；HPLC法；迷迭香酸

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）20-0057-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320013

Determination of Rosmarinic Acid in Prunellae Spica Seeds and Oil-type Prunellae Spica Seeds by HPLC

HUANG Zhiyun1 SUN Weiguang1* LI Qiyan2 CHEN Bin3 WANG Anfeng1 GAO Jiansheng1

1.Guangzhou Baiyunshan Xingqun Pharmaceutical Co.，Ltd.， Guangzhou 510288， China;

2. Guangzhou Special Service Recuperation Center of PLA Rocket Force， Guangzhou 510010， China;

3. Jiangxi Xinkangjian Ecological Agriculture Development Co.， Ltd， Xinyu 336500，China

Abstract：

Objective To establish a method for determination of rosmarinic acid in Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds by HPLC. Methods Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm） column was used and the column temperature was 25℃， the detection wavelength was 330nm， the mobile phase was acetonitrile-Methanol-0.1%H3PO4 solution 18∶16∶66）， the flow rate was 1.0mL/min. Results thelinear ranges ofrosmarinic acid was 0.20-1.23μg （R2＝0.9993）; and the average recoveries of rosmarinic acid in Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds was 99.22%（RSD 1.70%）， 100.15% （RSD 2.04%）， respectively.Conclusions The method is simple， reliable， efficient， and can be used for determination of rosmarinic acid in Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds.

Keywords：Prunellae Spica Seeds; Oil-type Prunellae Spica Seeds; Content Determination; HPLC; Rosmarinic Acid

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，始载于《神农本草经》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一种药食同源的多年生草本植物，至今已有几千年的药用历史，现收载于2020年版《中国药典》。夏枯草味苦、辛，性寒，归肝、胆经，可清肝散火、明目、散结消肿［1］。对目赤肿痛、畏光流泪、目珠夜痛、头晕目眩、瘰疬、瘿瘤、乳腺癌、高血压、淋巴结核、浸润性肺结核、单纯性甲状腺肿、腮腺炎、急性黄疸型传染性肝炎等均有良好的临床治疗效果。现代研究［2-3］表明，夏枯草中含有多种化学成分：包括三萜、甾醇、黄酮、有机酸、香豆素等类型化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血压、降血糖、降血脂等药理作用。夏枯草籽为唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥成熟种子，为夏枯草的生殖种子，应具有与夏枯草一致的遗传活性物质与作用。因此，夏枯草籽及夏枯草籽油在食用、保健或药物中具有较大的开发前景，但其应用价值还未受到重视，并未见到其相关报道。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一种多酚酸，化学名为：R（+）2-［3-（3，4-二羟基苯基）-1-氧代-2-丙烯基］氧基-3，4-二羟基苯丙酸，广泛分布于唇形科、紫草科、葫芦科等植物中，是夏枯草的主要有效成分之一。现代药理研究［4-5］表明，迷迭香酸具有抗氧化、抗菌抗炎、抗肿瘤、抗抑郁和抗焦虑、改善肾脏疾病、保肝等多方面药理学活性。

本文首次发现夏枯草籽及夏枯草籽油中富含迷迭香酸类成分，利用极性溶剂提取法将脂溶性成分与迷迭香酸类极性成分分离。目前尚未有专门针对夏枯草籽和夏枯草籽油的含量控制方法，鉴于迷迭香酸为夏枯草主要有效成分之一，药理活性广泛，以及《中国药典》中夏枯草含量控制指标成分为该成分，有必要建立以迷迭香酸为含量指标的夏枯草籽及夏枯草籽油质量控制方法，为下一步的开发利用提供参考。本文采用HPLC法测定夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量，为质量控制提供了实验方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BY-500A高速万能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司生产；赛默飞U3000系列高效液相色谱仪（U紫外检测器），德国赛默公司生产；BT125D型十万分之一电子分析天平，德国赛多利斯公司生产；XPR36型百万分之一电子分析天平，梅特勒-托利多；SB25-12TD型新芝超声清洗机，愽纳清洗设备有限公司；紫外光灯；水浴锅；常用玻璃仪器；干燥箱。

1.2 材料磷酸、甲醇为分析纯、甲醇、乙腈为色普纯，迷迭香酸对照品（批号111871-202007，含量：98.1%），由中国食品药品检定研究院提供。夏枯草籽（批号：20220314，20220325，20220402），由江西鑫康健生态农业开发有限公司提供，经南方医科大学中医药学院刘传明副教授鉴定为唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥种子；夏枯草籽油（批号：20220318，20220329，20220406），由江西鑫康健生态农业开发有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备精密称取迷迭香酸对照品4.09mg，置于100mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，即得迷迭香酸对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 夏枯草籽供试品溶液的制备取夏枯草籽，粉碎破壁，过40目筛，称取夏枯草籽粉约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，精密称重，超声处理（功率600 W，频率40 kHz）60min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得夏枯草籽供试品溶液。

2.2.2 夏枯草籽油的制备 ①夏枯草籽的破壁：将纯净的夏枯草籽置于粉碎破壁机中，选用40目孔径的粉碎破壁机筛网进行粉碎破壁；将粉碎破壁机置于（10±2）℃的环境下；或是在粉碎破壁机的发热部位外部加装制冷循环水装置，并保持粉碎温度在15℃以下；开启机粉碎，粉碎后的夏枯草籽粉置于孔径为40目的筛网中，振摇过筛，让粒径小于筛网网孔的草籽粉通过，不能通过的草籽粉加入粉碎机中继续粉碎破壁，直至全部通过为止，获得破壁的夏枯草籽粉。②与夹带剂混匀。加夹带剂混合：往上述破壁夏枯草籽粉原料中加入极性夹带剂甲醇，按一定比例混合均匀；将混合均匀的粉体均匀地填充于超临界CO2萃取釜中。③超临界萃取。静态浸泡萃取：将上述填充好夏枯草籽混合粉体的超临界CO2萃取釜，升温至45℃的温度，通以CO2超临界流体升压至20MPa的压力，停泵，静态浸泡提取40min；动态萃取：静态浸泡提取40min后，当分离器的温度及压力达到设定值时开始动态萃取并计时，萃取时间120min；采用二级分离，分离的工艺条件是：一级解析器压力为10MPa，分离温度37℃；二级解析器压力为4MPa，分离温度27℃；获得黄绿色的夏枯草籽油。④过滤除杂。取上述夏枯草籽油，置于孔径为350目的过滤装置中减压抽滤，弃去不能滤过的杂质，得清澈的夏枯草籽油。

2.2.3 夏枯草籽油供試品溶液的制备取夏枯草籽油约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100mL，超声处理（功率600W，频率40kHz）60min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置让乳化液分层澄清，取50%甲醇部分，滤过，取续滤液，得夏枯草籽油供试品溶液。

2.3 色谱条件采用Ultimate XB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温为25℃，检测波长为330nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（18∶16∶66）。

2.4 专属性精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，分别进样 10 μL，按 2.3项色谱条件测定，结果从色谱图如图1～4可知，迷迭香酸对照品HPLC色谱图中，在保留时间10.3min左右有迷迭香酸对照品的吸收峰呈现，在夏枯草籽及夏枯草籽油的HPLC色谱图中均在保留时间10.3min左右有迷迭香酸的吸收峰出现，且峰形与迷迭香酸对照品的峰形一至，分离度良好，而在空白提取溶剂的HPLC色谱图中未见迷迭香酸的吸收峰，表明阴性对照无干扰。

2.5 线性关系考察取“2.1”项下对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.3”项下色谱条件，分别取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL进样，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；得回归方程：Y＝39.886X-0.0115，R2＝0.9993，表明迷迭香酸在0.20～1.23μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验精密吸取“2.1”项下迷迭香酸对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算迷迭香酸峰面积值的平均值为16.26，RSD为0.69%，峰面积值的RSD<2%，结果见表2；结果表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验取“2.2.1”项下的夏枯草籽供试品溶液及“2.2.2”项下的夏枯草籽油供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h，分别进样10 μL，测定迷迭香酸峰面积值，计算夏枯草籽供试品中迷迭香酸峰面积值的平均值为23.56，RSD为0.99%；计算夏枯草籽油供试品中迷迭香酸峰面积值的平均值为25.35，RSD为0.93%；测得两个样品中迷迭香酸峰面积的RSD均<2%，表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.8 重复性试验取同一批号夏枯草籽样品（批号20220314），按“2.2.1”项下的夏枯草籽供试品溶液的制备方法制备6份夏枯草籽样品液；取同一批号夏枯草籽油样品（批号20220318），按“2.2.2”项下的夏枯草籽油供试品溶液的制备方法制备6份夏枯草籽油样品液；分别按“2.3”项下色谱条件，进样测定，计算迷迭香酸含量；夏枯草籽样品中迷迭香酸含量的平均值为0.59%，RSD为0.98%；夏枯草籽油样品中迷迭香酸含量的平均值为0.80%，RSD为0.94%；测得两个样品中迷迭香酸含量的RSD均<2%，表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验精密称取已知含量同一批号夏枯草籽样品（批号20220314）6份，每份0.5 g，分别精密加入相当于样品中迷迭香酸含量100%的对照品溶液适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液；精密称取已知含量同一批号夏枯草籽油样品（批号20220318）6份，每份0.4 g，分别精密加入相当于样品中迷迭香酸含量100%的对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液；再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算迷迭香酸含量及回收率，结果夏枯草籽样品中迷迭香酸的平均回收率为99.22%，RSD为1.70%，夏枯草籽油样品中迷迭香酸的平均回收率为100.15%，RSD为2.04%。结果见表1。

试验结果表明：夏枯草籽的迷迭香酸回收率在97.11％～101.26％之间，夏枯草籽油的迷迭香酸回收率在97.58％～102.67％之間，两批样品的加样回收良好。

2.10 三批夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量测定按“2.3”项下色谱条件分别测定3个不同批次的夏枯草籽及3个不同批次的夏枯草籽油样品中迷迭香酸的含量。结果见表2。

测得三批夏枯草籽中迷迭香酸的含量在0.54%～0.71%之间；测得三批夏枯草籽油中迷迭香酸的含量在0.69%～0.96%之间。

3 讨论

本文首次发现夏枯草籽及夏枯草籽油中富含迷迭香酸类成分，并首次建立了夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的检测方法。研究结果表明，夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量测定在线性范围内线性良好，其精密度、稳定性、重现性、回收率试验均符合要求。

压榨法、常规超临界CO2萃取制备方法所制备的夏枯草籽油中很少含有或不含有迷迭香酸成分，试验所用的夏枯草籽油为使用极性夹带剂的超临界CO2萃取制备方法所制备的夏枯草籽油，克服了常规超临界CO2萃取制备方法操作压力大、萃取时间长、对设备要求高、能耗大、提取容量少、萃取率不够理想等缺点，提高了迷迭香酸的提取率［6-9］。

《中国药典》中夏枯草药材含量要求为含迷迭香酸不得少于0.20%，本研究中夏枯草籽中迷迭香酸的含量在0.54%～0.71%之间，夏枯草籽油中迷迭香酸的含量在0.69%～0.96%之间，含量远远高于药典要求的下限，本研究为夏枯草籽及夏枯草籽油的开发和利用提供了方法和依据。

参考文献

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