温针内、外膝眼穴对膝骨性关节炎大鼠RhoA/ROCK信号通路的影响

石欣悦 洪昆达

基金項目：福建省卫健委中青年骨干人才项目（2020GGA056）；福建医科大学附属第二医院博士启动基金（BS202005）。

作者简介：石欣悦（1997—），女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为针推防治脊柱与骨关节疾病。E-mail：3062807751@qq.com

通信作者：洪昆达（1981—），男，汉族，博士，副主任医师、硕士生导师，研究方向为针灸防治骨关节病。E-mail：hongkundafz@163.com

【摘  要】  目的：探讨温针内、外膝眼穴对膝骨性关节炎大鼠RhoA/ROCK信号通路上关键因子的影响，进一步明确温针的作用靶点，为临床中使用温针治疗KOA提供分子理论依据。方法：将24只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组与温针组，每组各8只。采用木瓜蛋白酶法复制膝骨性关节炎模型；空白组与模型组同等抓取固定，温针组采用温针治疗；期间观察大鼠的一般情况。HE染色法观察膝关节软骨组织形态学变化，实时荧光定量PCR法（q-PCR）检测大鼠膝关节软骨组织内RhoA、ROCK与ERK1/2的基因表达。结果：空白组大鼠软骨组织四层结构规整清晰，基质染色均匀，未见异常。与空白组相比，模型组大鼠膝关节软骨表层可见局部缺损，软骨细胞排列紊乱，基质染色变浅，RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表达均明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.01），ERK1 mRNA表达变化未见明显差异（P＞0.05）。温针组软骨组织形态总体优于模型组，ROCK mRNA的含量相较于模型组显著下降（P＜0.01），其余指标两组间统计学差异不显著（P＞0.05）。结论：本研究结果表明RhoA/ROCK信号通路参与早期膝骨性关节炎的发展；温针可能通过抑制ROCK的基因表达参与调控RhoA/ROCK信号通路，从而缓解KOA症状，改善一般情况，延缓软骨组织退变。

【关键词】  膝骨性关节炎；温针；RhoA；ROCK；ERK1/2

【中图分类号】R245    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）20-0015-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320005

Effects of Warm Needle Moxibustion at EX-LE4， ST35 on RhoA/ROCK Signaling

PathwayinKnee Osteoarthritis Model Rats

SHI Xinyue1  HONG Kunda1，2*

1.College of Acupuncture， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122，China;

2. Rehabilitation Medicine Department，The second affiliated hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000，China

Abstract：Objective The purpose is todiscuss the effects of warm needle moxibustion at EX-LE4， ST35 on RhoA/ROCK signaling pathway in knee osteoarthritis rats， and to further clarify the target of warm needle moxibustion， so as to provide molecular theoretical basis for clinical practice. Methods 24 SPF male SD rats were randomly divided into blank group， model group and warm needle moxibustion group（WNM）， with 8 rats in each group. Papain was used to replicate knee osteoarthritis model， the blank group and the model group were same gripped and fixed as the WNM group， and the WNM group was treated with warm needle therapy， during which the general condition of the rats was observed. The morphologic changes of knee cartilage were observed by HE staining， and the gene expressions of RhoA， ROCK， ERK1/2 in the knee cartilage of rats were detected by q-PCR. Results In blank group， the structure of the four layers of cartilage tissue was clear and regular， the matrix staining was uniform， and no abnormality was observed. Compared with the blank group， local defectson the surface， disordered chondrocytes and lighter matrix staining were observed of knee cartilage in model rats， and the expressions of RhoA mRNA， ROCK mRNA and ERK2 mRNA in model group were significantly increase， which had statistical significance （P<0.01）， while there was no difference in the expression of ERK1 mRNA between model group and WNM group（P>0.05）. The cartilage morphology of WNM group was better than that of model group in general， and the content of ROCK mRNA was significantly decreased compared with model group （P<0.01）， while the other indexes were not statistically significant between the two groups （P>0.05）. Conclusions The result of this study indicates that the main factors of RhoA/ROCK signaling pathway， is involved in the development of early knee osteoarthritis. Warm needle moxibustion can relieve the symptoms of knee osteoarthritis， improve the general condition and delay cartilage degeneration. It may regulate the RhoA/ROCK signaling pathway mainly by inhibiting the expression of ROCK mRNA.

Keywords：Knee Osteoarthritis; Warm Needle Moxibustion; RhoA; ROCK; ERK1/2

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是导致老年患者残疾的最常见的慢性膝关节疾病之一［1］，其发病率随着年龄的增长而增加，发病机制尚未完全明确，以不可逆的膝关节软骨退变、破坏及软骨下骨骨质增生为主要特征［2］，且临床暂无特效药物，以疼痛为主的诸多症状对患者的生活质量造成了极大负面影响。保守治疗对改善轻中度KOA症状、延缓KOA病程意义重大，然而长期口服非甾体抗炎药对胃肠道具有一定副作用，膝关节腔注射药物亦有其局限性［1，3］。温针疗法具有简、便、效、廉的特点，诸多研究证明温针治疗KOA疗效肯定［4］，无明显不良反应［5，6］，但其起效机制仍在进一步探索中。

有研究［7］表明RhoA/ROCK信号通路与KOA的发生发展密切相关：骨性关节炎发生时，软骨细胞将经历肥大、终末分化、骨化、凋亡这一系列过程［8］，软骨细胞肥大等形态改变与分化、骨化、凋亡等生物活性均可受细胞骨架介导，软骨细胞骨架破坏是导致关节软骨发生退行性变的重要因素之一［9］。RhoA与ROCK是参与细胞骨架调控的重要因子，当ROCK被活化的RhoA激活后，能进一步靶向调控ezrin、tau等细胞骨架相关蛋白，亦可通过LIM激酶（LIMK）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK），分别对底物肌动蛋白解聚因子和肌球蛋白轻链进行调节，继而影响肌动蛋白丝，改变软骨细胞骨架排列［7，10］。除此之外，活化的RhoA、ROCK还能与Ras-Raf-MEK信号通路产生协同作用，共同调控ERK1/2的表达，而ERK1/2与KOA病程同样有所关联［11］。故本研究从RhoA/ROCK信号通路着手，观察温针对KOA模型大鼠RhoA/ROCK信号通路上关键因子RhoA、ROCK与其下游ERK1/2基因表达情况的影响，结合组织形态学，初步探讨温针治疗KOA可能存在的作用机制，以期为临床中使用温针治疗KOA提供分子理论依据。

1  材料与方法

1.1  实验动物  2月龄SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0008。分笼饲养，每笼4只，自由饮水进食，适应性喂养1周。因后续干预过程中温针组1只大鼠死亡，故温针组最终样本量为7只。

1.2  主要试剂与仪器  木瓜蛋白酶（上海麦克林生化科技有限公司，P6321），异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，R510-22-10）。艾段（南阳仲圣药业有限公司，规格0.7 cm×1 cm），华佗牌一次性使用无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格0.25 mm×13 mm）。多聚甲醛固定液、EDTA脱钙液、HE染液套装（均来自武汉赛维尔生物科技有限公司）。强化RNA提取试剂盒 TransZol Up、反转录试剂盒All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、实时荧光定量PCR试剂盒 Green qPCR SuperMix（+Dye II）（均来自北京全式金有限公司），qPCR引物（由福州尚亚生物技术有限公司提供）。ZHPW-250恒温摇床（BLabotery），

病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），正置光学显微镜（日本尼康株式会社），Centrifuge 5424R高速低温离心机（Eppendorf中国有限公司），NanoDrop One微量紫外-可见光分光光度计、ABI QuantStudio 3荧光定量PCR仪（均为赛默飞世尔科技（中国）有限公司）。

1.3  动物分组与造模  随机数字法将24只SD大鼠均分至空白组、模型组与温针组（8只/组）。除空白组外，其余大鼠采用木瓜蛋白酶法［12］复制膝骨性关节炎模型，动物用异氟烷麻醉，仰卧位置于操作台，施术部位消毒，术者从髌韧带外侧凹陷处进针，依次向大鼠左、右膝关节腔注射4％木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.2 mL，注射完毕助手以无菌棉球按压针眼防止药液流出，并拉伸大鼠下肢使大鼠膝关节被动屈伸10次左右，帮助药液充分吸收。给药在适应性饲养后的第1天、第4天、第7天进行，最后一次注射结束后正常饲养2周让模型发展。期间观察大鼠精神状态、毛色、活动量、进食、饮水等一般情况。

1.4  干预方法  用黑袜与自制固定板将大鼠仰卧位固定，膝关节保持自然屈曲。空白组与模型组同等抓取固定，不进行治疗。温针组采用温针灸法，取双侧内膝眼、外膝眼（选穴定位方法参考《实验针灸学》［13］），穴位局部消毒后以毫针向膝关节方向直刺约5 mm，并在针柄处放置艾段，从下方点燃，1壮燃尽后更换另1壮，共灸2壮，留针20 min；每日1次，干预6 d休息1 d，共干预2周。期间观察大鼠精神状态、毛色、活动量、进食、饮水等一般情况。

1.5  取材及检测指标  末次干预结束后动物禁食12 h，不禁水，次日取材。麻醉后，每组随机选取4只大鼠，用手术刀刮取搜集其右侧膝关节胫骨平台与股骨髁软骨组织碎片，-80 ℃储存，用于后续q-PCR检测。每组其余大鼠的膝关节用于组织形态学对比观察，完整分离关节后将其放入多聚甲醛中固定24 h，随后EDTA脱钙、常规脱水、包埋、切片（4 μm厚）及脱蜡后，按HE染液套装说明书进行染色操作。软骨组织碎片液氮研磨后

用强化 RNA提取试剂盒

提取软骨组织总RNA，测其浓度后，以RNA为模板按反转录试剂盒说明书配制RT反应液，42 ℃孵育15 min，85 ℃灭活5 s后得到cDNA；

按實时荧光定量 PCR 试剂盒说明书配制qPCR反应液，总反应体系20 μL，94 ℃30 s预变性后，94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s循环40次；以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算RhoA、ROCK、ERK1/2的mRNA相对表达量。具体引物序列见表1。

1.6  统计学方法  采用软件SPSS 23.0进行数据统计分析，计量资料采用均数加减标准误表示，符合正态分布的多组计量资料采用单因素方差分析，根据方差是否齐平进一步用LSD检验或Games Howell检验进行两两比较；若多组计量资料不符合正态分布则采用多样本秩和检验。检验水准α=0.05，即P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1  一般情况  空白组大鼠一般情况全程未见异常，精力充沛，毛发柔顺、富有光泽，活动如常、行动敏捷，饮食二便如常，膝关节骨性标志明显。模型组与温针组大鼠造模期间精神萎靡，毛发失去光泽、略显干枯，活动明显减少、喜蜷缩，饮食尚可，大便基本正常。干预期间，模型组与温针组大鼠精神状态及毛发色泽均有所恢复，模型组仍不喜活动，行走缓慢，饮食二便未见明显异常，触摸发现膝关节骨性标志变浅明显；温针组毛发较模型组更具光泽，随着干预次数增加活动逐渐增多，可见跑、跳动作，饮食二便正常，触摸发现膝关节骨性标志变浅，但对局部按压刺激反应较小。

2.2  各组大鼠膝关节软骨组织形态学对比  HE染色后，软骨基质与胞质呈粉色，软骨细胞核呈深蓝色。空白组大鼠膝关节软骨组织四层结构清晰规整，表层完整光滑，中间层与放射层软骨细胞呈条索状整齐排列，基质染色均匀，未见异常；KOA模型大鼠膝关节软骨表层毛躁，可见局部裂痕，软骨细胞数量弥漫性增加、排列紊乱，基质染色轻度变浅；温针组软骨表层完整，软骨细胞数量弥漫性增加、排列略不规则，基质染色稍不均匀，但均优于模型组。如图1、图2所示。

2.3  各组大鼠目的基因相对表达量比较  模型组大鼠膝关节软骨组织内RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表达相较于空白组均明显升高，统计学差异显著（P＜0.01）；而模型组大鼠膝关节软骨组织内ERK1 mRNA的表达与空白组对比不具有统计学意义（P＞0.05），暂不可认为两组间ERK1的基因相对表达量有所差异。与模型组对比，温针组RhoA/ROCK信号通路的RhoA及通路下游ERK1/2的基因表达变化差异未达到统计学意义（P＞0.05），温针组ROCK mRNA表达则明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2，如图3所示。

3  讨论

3.1  RhoA/ROCK信号通路与KOA  Rho蛋白家族属于Ras超家族，是一组分子量在20～25kDa的小GTP结合蛋白，具有GTP酶活性，又称作Rho GTP酶［14］；RhoA是Rho蛋白家族的成员之一，在例如细胞生长、转化和细胞骨架调节等多个细胞过程中发挥重要作用［15］，其通过与GDP结合时失活，而与GTP结合时活化的方式，起到“分子开关”的作用。ROCK全称Rho激酶（Rho kinase，ROCK），是RhoA下游重要的效应靶标［16］，在细胞收缩、迁移、凋亡、存活与增殖等过程中发挥多种功能［17］。RhoA-GTP与ROCK的Rho结合结构域（RBD）结合使之构象发生改变，ROCK的自身抑制解除从而被激活，继而向下传递胞外信号，发挥效用［18］。

现代研究发现KOA发展过程中确实存在RhoA/ROCK通路的异常激活：文刚等［19］搜集OA患者的关节软骨组织进行体外软骨细胞培养，研究表明与正常对照组软骨组织对比，OA组软骨细胞RhoA、ROCK1/2的mRNA与蛋白表达水平均高于正常对照组，差异具有统计学意义，提示RhoA/ROCK通路异常激活可能是诱导骨性关节炎形成的重要原因之一；Tiftik R N等［20］在IL-1β诱导的骨性关节炎炎症反应和氧化应激的研究中发现ROCK抑制剂法舒地尔可降低ROCK2、IL-6、TNF-α、COX-2等因子的蛋白表达，ROCK抑制剂可能是一种治疗OA患者的有益选择。另一方面，又有研究表明抑制RhoA/ROCK信号通路将阻碍软骨细胞的分化形成：转录因子SOX9直接调节构成软骨细胞外基质的主要蛋白聚糖和胶原蛋白的表达，Haudenschild D R等［21］研究发现SOX9包含ROCK的共有磷酸化位点，ROCK通路的激活能导致Sox9磷酸化与转录激活来调节软骨细胞基因表达，促进软骨分化；而Zhong  W等［22］也发现ROCK抑制剂和YAP/TAZ的敲低会破坏骨髓间充质干细胞的纤维软骨形成分化，影响软骨细胞形成。

3.2  RhoA/ROCK与ERK1/2  MAPKs是一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，ERK1/2是其重要一支，且与KOA病程联系紧密：激活p38MAPK与ERK1/2通路将诱导骨性关节炎炎症反应，加剧软骨退化进程，抑制ERK1/2信号通路则可减轻外界刺激对软骨细胞的不利影响［23］。在经典的ERK1/2通路中，细胞膜上配体诱导的受体酪氨酸激酶（RTK）激活并招募GTP结合形式的小GTP酶Ras，随即触发Raf的二聚化和激活，从而启动下游磷酸化级联反应，依次激活MEK和ERK［24］。RhoA/ROCK信号通路已被诸多研究证明位于ERK1/2上游，且RhoA/ROCK信号通路被激活后，能协同Ras-Raf-MEK信号通路调控ERK1/2的表达［11］。但RhoA/ROCK对ERK存在差异性调控，目前仍在探讨中：Taglietti V等［25］研究发现RhoA/ROCK轴对ERK呈负性调节，即RhoA和ROCK激活会抑制ERK激酶活性，从而促进核因子Nfix及其激活剂JunB的表达；姚海华等［26］则通过动物实验发现运用ROCK抑制剂Y27632能够降低MEK、ERK1/2的基因与蛋白表达。这种差异可能和RhoA不同位点被ERK1/2磷酸化相关，还待深入研究［27］。

3.3  温针对RhoA/ROCK信号通路的影响  在针对KOA的治疗中，RhoA/ROCK及下游的ERK1/2表达差异同样值得探讨。如叶国平［11］的研究表明，与正常组对比，KOA模型大鼠体内的RhoA、ROCK、ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表达均明显升高，电针治疗可在不同程度上降低上述指标的蛋白表达，延缓膝关节软骨退变；杨宜锜等［28］则发现ERK信号通路被鸢尾素激活后，反而抑制了骨细胞凋亡、缓解骨性关节炎病程。本研究结果显示，模型组大鼠膝关节软骨组织形态出现软骨表层局部轻度缺损、软骨细胞排列失序等改变，软骨组织内的RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表达与空白组相比均有所上调，ERK1 mRNA表达变化无统计学意义，提示KOA病程早期确实存在RhoA/ROCK信号通路的异常激活，且对下游ERK1/2的影响程度存在差异；温针组大鼠毛发、活动量、膝关节对疼痛刺激的反应等一般情况相较模型组均有所改善，膝关节软骨组织形态改变介于空白组与模型组之间，ROCK mRNA的含量相较于模型组显著下降，其余指标如RhoA、ERK1 mRNA虽略微高于模型组、ERK2 mRNA较模型组虽有降低趋势，但两组间统计学差异均不显著。本实验结果表明温针能有效缓解膝骨性关节炎症状，改善一般情况，对关節软骨有保护作用，温针可能主要通过抑制ROCK的基因表达参与对RhoA/ROCK信号通路的调控。因本研究造模给药结束至取材共历时4周，温针干预仅有2周，干预周期与其他研究的疗程存在一定差异，可能还不足以使温针对RhoA/ROCK信号通路产生较大影响，日后可以考虑调整干预频次、延长干预周期等以更符合临床实际，具体还待更进一步研究。

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（收稿日期：2023-02-07  编辑：刘  斌）