海藻寡糖的化学法降解制备技术研究进展

孙 林, 宋 宛 霖, 钟 志 海, 刘 正 一

( 1.中国科学院 烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003;2.中国科学院 海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071 )

0 引 言

海藻是一类低等水生孢子植物,富含海藻多糖[1]。海藻多糖就来源可分为褐藻多糖、红藻多糖和绿藻多糖三大类,具有多种生物活性[2-3]。海藻多糖分子质量较大、溶解度低、生物利用度低,因此在医学、材料等方面的利用效率也较低,在应用方面受到很大限制[4]。

海藻寡糖是来自海藻细胞壁中海藻多糖的降解产物[5],是聚合度在2～10的直链或支链化合物。海藻寡糖的组成各不相同,例如琼胶寡糖由琼二糖为重复单位连接而成;褐藻胶寡糖由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通过β-1,4-糖苷键连接而成[6]。相较于海藻多糖,海藻寡糖具有溶解度高、分子质量低的特点,分子质量通常小于2 000 u。海藻寡糖具有多种生物活性,如保护细胞结构[7]、抗氧化[8]、促生长[9-11]、诱导植物抗逆性[12-13]、产品保鲜[14-15]等,在农业[16-18]、医药[19-20]、食品[21]、化工[22]等领域具有独特的应用优势。对海藻寡糖的深度开发利用已成为当前海洋生物资源高值化应用的重要发展趋势[6](图1)。例如,当前海藻寡糖的高纯标准品产量低且价格高昂,每10 mg售价高达数百美元。如何降低生产成本,突破生产工艺,实现大规模制备高纯寡糖是目前海藻寡糖产业化研究的重点。

图1 海藻寡糖的应用

海藻寡糖因其优良的生物学活性受到越来越多的关注,但当前海藻多糖的降解制备工艺仍有较多局限性、成本较高等缺点,限制了寡糖的生产效率。深入研究开发新的制备工艺对于高值化、高质化利用海藻多糖为代表的海洋生物资源具有重要意义[23]。常用的海藻寡糖制备方法(表1)主要包括物理制备法、化学制备法和酶制备法[24]。物理制备法存在反应机理不明确、重复性不高,酶制备法存在成本较高、效率较低等不足[25],而化学法的效率高且成本低,因此是目前最成熟的海藻寡糖产业化模式。

表1 海藻寡糖3种制备方法的比较

海藻寡糖的种类有多种,其中,褐藻胶寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)、岩藻寡糖(Fucoidan oligosaccharides,FOS)、琼胶寡糖(Agar oligosaccharides,AGOS)、卡拉胶寡糖(Carrag-eenan oligosaccharides,COS)和浒苔寡糖(Enteromorpha oligosaccharides,EOS)等5种寡糖是褐藻、红藻、绿藻等海藻寡糖的主要组成部分。本文论述这5种代表性的海藻寡糖的化学法制备技术,以此介绍海藻寡糖的化学法制备技术共性和特殊点。

1 褐藻胶寡糖(AOS)

褐藻胶寡糖是褐藻胶的降解产物,具有溶解性好、分子质量小、稳定性强、易被机体吸收且安全性高等特点[25]。化学法制备褐藻胶寡糖包括光化学法、水热法、亚临界热解法、酸水解法、碱水解法、氧化还原法和有机合成法等方法(表2)。

表2 褐藻胶寡糖的化学制备法

表2所列方法中,光化学降解通过随机破坏褐藻酸钠的糖苷键进行;水热法降解则是先释放甘露糖醛酸(M),选择性断裂M-M糖苷键;亚临界热解法中,海藻酸盐中的键通过β-消除反应选择性地断裂,随着进一步水热分解,单体亚基中的C—C或C—O键断裂。氧化还原法降解机理:糖苷氧化产生共轭酸质子,共轭酸形成的非还原末端与碳-氧钅翁离子发生断裂,水分子加入碳-氧钅翁离子中形成还原末端,最终形成由G、M单糖构成的聚合度不等的寡糖[28]。

最常用的褐藻胶寡糖生产方法是酸水解法,使用的酸包括盐酸、草酸、甲酸和硫酸等[28]。由于海藻酸盐的耐酸性,海藻酸盐不能被无机酸完全降解。用多种酸综合水解海藻酸盐,与传统的酸水解法相比具有清洁、快速、产物产率高等特点。此外,还可以应用合成子组装从非还原端到还原端的糖链,以较高的选择性制备G-连接的寡糖,但反应需要多重的基团保护、去保护步骤,且只能合成聚合度小的寡糖,产量低[29]。

化学降解制备法所用化学试剂反应较剧烈,因此得到的产物都有活性较低的缺点。物理法与酶法制备得到的产物活性相对更高,但反应效率较低且成本较高。

实际生产的过程中通常采用多种方法结合应用,以提高生产效率和生产质量。例如,通过γ射线、H2O2、电离辐射和H2O2的组合处理,可以得到多种分子质量不同的低聚糖。相对于仅通过γ射线产生的低聚糖,这一方法将所需的射线剂量减少了90%[30]。在褐藻胶寡糖的生产中可以多种方法结合使用,以达到取长补短、提质增效的效果。

2 岩藻寡糖(FOS)

岩藻多糖多存在于褐藻中,是一种结合有硫酸基团的水溶性多糖,主要由岩藻吡喃环以α-1,3-糖苷键连接而成,同时夹杂着木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等糖类[31]。与岩藻多糖相比,岩藻寡糖因水溶性好、易被机体吸收利用、具有多种生物活性等优点,近年来更受人关注。

表3所列方法中,H2O2在氧化反应体系中产生羟自由基,羟自由基使岩藻多糖发生分子内的重排,进而断裂β-1,4-糖苷键,产生分子质量较小的低聚糖。酸水解法等的原理为采用酸性物质断裂糖苷键进而产生分子质量较小的低聚糖。此外,还有物理法和酶法降解。物理法降解包括超声波降解法或γ射线辐照制备岩藻寡糖。海洋软体动物大菱鲆消化腺中的一种蛋白提取物也可从岩藻聚糖中释放L-岩藻糖,并降低多糖的分子大小[34]。物理法与酶法制备得到的产物在活性方面均优于化学法制备得到的产物,但也有成本高效率低等缺点。

表3 岩藻寡糖的化学制备法

3 琼胶寡糖(AGOS)

琼胶是海洋中含量丰富的一类多糖,在制备生物材料等方面应用广泛。但它由于有类似于褐藻多糖的分子质量大等特点,在生物医学领域的应用受到很大限制。然而,琼胶寡糖的分子质量相对较小,有着易降解吸收等优点。琼胶寡糖的聚合度一般为2～10,制备方法包括化学降解法和酶降解法,降解产物包括琼寡糖和新琼寡糖[35]。裂解琼胶的α-1,3-糖苷键,生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖;裂解琼胶的β-1,4-糖苷键,生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖。

表4 琼胶寡糖的化学制备法

酸降解法应用最为广泛,普遍采用的是浓度较稀的盐酸、硫酸、柠檬酸等降解制备琼胶寡糖。降解时通常采用直接加酸降解、逐级加酸降解、非均相降解等方法。

酶法制备琼胶寡糖具有反应效率高、产物专一性好、反应条件温和易控制、无污染等诸多优势,同时酶法制备得到的产物活性比化学法更高。但是酶制剂分离困难、产量有限、成本高,因而使酶法制备无法大规模应用于生产。

4 卡拉胶寡糖(COS)

卡拉胶主要来源于红藻的细胞壁,应用较广泛,但同时有分子质量大、黏度大、空间结构复杂等特点,进而影响其生物活性。根据半乳糖中是否含有内醚以及半乳糖上硫酸基的数量和连接位置不同分为κ-、ι-和λ-型卡拉胶,对应的卡拉胶寡糖也包括κ-、ι-和λ-型卡拉胶寡糖。卡拉胶寡糖是卡拉胶降解后的产物,分子质量较小,具有溶解度高、稳定性好等优点,同时安全性较高。

表5所列方法中,甲醇盐酸法对卡拉胶进行水解,可以降解卡拉胶的半乳糖苷键和3,6-脱水半乳糖苷键;无机酸可以断裂卡拉胶分子长链中的糖苷键,两种方法均为断裂单元间糖苷键制备卡拉胶寡糖。

表5 卡拉胶寡糖的化学制备法

物理降解法也可以制备卡拉胶寡糖,但反应过程和反应得到的产物较难控制,同时产物结构容易被破坏。酶降解法有反应专一性好、条件温和、底物专一等优点,但成本高且难以扩大生产规模。卡拉胶酶都是内切酶,能够切割卡拉胶的内部β-1,4-糖苷键并产生一系列偶数的寡糖[41]。酶降解法由于可以使多糖按规律降解制备为寡糖,反应温和,因此酶降解法制备得到的产物活性优于物理降解法和化学降解法。

5 浒苔寡糖(EOS)

浒苔是我国沿海地区常见的一种大型绿藻[42]。近年来,我国黄海海域连年爆发由浒苔构成的绿潮,生物量高达千万吨[43],对海洋生物生存、海洋运输构成严重影响,因此对浒苔资源进行规模化开发利用具有重要的经济和社会价值。浒苔多糖主要由鼠李糖、木糖、葡萄糖等单糖组成,富含糖醛酸和硫酸基,主链中各单糖间有多种链接键型[44]。浒苔寡糖是浒苔多糖降解后的产物,相对于浒苔多糖具有更好的溶解性和更显著的降血脂、抗病毒等功效[45]。

浒苔寡糖的降解制备(表6)中,酸解法是最常用的方法,但在降解过程中易发生硫酸基团脱落的现象。氧化降解法可减少硫酸基团脱落,但产物组成复杂且分离纯化困难[48]。酶解法反应条件温和、专一性强,但反应过程中易形成不饱和键,且酶的制备选择较困难[49]。因此制备时可以将化学法与酶法相结合制备,以达到提质增效的目的。

表6 浒苔寡糖的化学制备法

6 结论与展望

化学法降解制备工艺是目前规模最大的海藻寡糖制备方法,也是当前最成熟的产业化模式。但是几种海藻寡糖的产业化发展和研究进展不同,褐藻寡糖和红藻寡糖的研究和制备规模较大,绿藻寡糖的研究较少,但同样面临产物活性低和难以实现清洁化生产的问题。酸法或氧化法降解制备寡糖有反应快速、效率高的优点,但同时也有反应过于剧烈、较难控制、寡糖活性较低等缺点。推测将物理法或酶法与化学法相结合是制备工艺发展的趋势之一,可以此保证产物的聚合度和活性,达到精准化制备的目的,同时减少环境污染问题。当前海藻寡糖的高纯产品,如标准品市场的产量低且价格高昂,因此高纯度、单一聚合度的寡糖具有广阔的市场前景。

在应用方面,由于化学法制备得到的寡糖聚合度范围较大,因此可以将其运用到农肥、饲料和水产饵料等对聚合度要求不高的应用领域,拓展应用范围,提高应用效率,更好地服务于生态农业和生态养殖业的提质增效。我国化肥使用量巨大,占世界10%的耕地消耗了全球30%的化肥。由于海藻肥中的海藻寡糖等活性成分具有提质增效的效果,可以实现化肥的增效减施,因此海藻肥的应用具有很大的市场前景。根据国家统计局查询的数据显示,我国农用化肥施用折纯量在近十年呈现出先增长后降低的趋势,分析原因为2015年农业部制定了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》,此方案促进了化肥的减施,取得了明显成效。但当前化肥施用量仍然巨大,在化肥减施方面还有较大发展空间。在之后的农业生产中,推广使用海藻肥逐渐替代化肥,将是促进减少化肥用量,同时保证农作物产量的有效途径。