基因功能验证方法及研究进展

雷 华,赵广展,林志艺*

(1.福建农林大学林学院/生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室,福州 350002;2.福建省闽侯县廷坪乡林业站,福建 闽侯 350104 )

目前,基因研究方向已由结构研究转向功能研究,在探索早期中,Thomopsson创建的ES细胞基因敲除小鼠模型,为基因敲除技术奠定了基础[1]。近几年来,出现了许多基因功能验证方法,如基因敲除技术、ZFN技术、TALEN技术、RNA干扰等,这些方法被广泛运用于植物、动物、细菌等生物群中。上述技术极大缩短了基因功能验证所需要的时间,且这些方法的作用机制具有较高的特异性。对基因功能的深入研究有助于推进医学、植物学和昆虫学等领域的发展,探究其发展具有重要的意义。

1 基因敲除技术

基因敲除技术是目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一,主要分为传统基因敲除技术和新兴基因敲除技术。传统基因敲除技术依靠细胞内自然发生的同源染色体的随机交换或者大规模随机插入突变来达到基因敲除的目的,如同源重组技术、T-DNA插入突变技术和转座子插入突变技术等[2]。新兴基因敲除技术为可控的定点敲除,如ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技术等,这些技术在基因敲除的效率方面有所提高,为基因功能验证提供了新的途径[2]。

1.1 同源重组

利用已知序列及功能的DNA片段与目的基因发生同源重组来改变生物的遗传基因,使得目的基因功能表达被中断,进而观察生物形态和行为的变化,推测出目的基因在生物学上的功能[2]。该技术由于生物体内自发的同源染色体随机交换效率极其低下,以至于实际操作量大,限制了其发展[2]。

目前,在小鼠研究中已具有的完备胚胎干细胞系统以及可行胚胎重建技术,因此,该技术广泛运用于小鼠基因敲除模型的构建。但由于这两项技术的发展速度缓慢,导致该技术并未运用于众多大动物。且随着新基因编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9等)的出现,更多的基因敲除模型不仅仅局限于该技术,如基因修饰兔的构建[3]、糖原贮积症0型斑马鱼疾病模型的构建[4]、FOXN1基因敲除猪模型的构建[5]。

1.2 插入突变

1.2.1 T-DNA插入突变 通过农杆菌T-DNA介导的转化将目的基因的DNA序列整合到基因组DNA上。该技术能便捷地进行正反向的遗传学研究,但其具有较强的限制性,主要是由于植物的生物学、遗传学特性及T-DNA标签载体的不完善,使该技术仅能运用于少数模式植物[6]。

近年来,在拟南芥与水稻的研究中广泛运用[7],在拟南芥基因组中已有超过225000个T-DNA插入系,已知超过88000个T-DNA插入的精确位置,且已鉴定了大约29454个预测拟南芥基因中的21700的突变[8]。在水稻的基因组中已有至少200000的T-DNA插入系,也已经产生了用于反向遗传学方法的标记系[9]。

1.2.2 转座子插入突变 转座子是一类可移动遗传因子,可引发基因重组和变异,该技术利用插入转座子来产生易于识别的突变[10]。目前,高通量DNA测序与转座子插入突变相结合形成转座子插入测序(TIS)。TIS迄今为止运用对象多为细菌物种,不仅解决与细菌基因相关的基本问题,还证明了细菌在众多人类疾病中起着主要作用。另外有一些相似于TIS的方法已开发运用于哺乳动物,真菌,寄生虫和古菌[11]。如通过PB转座系统成功地将转录因子导入小鼠和人的成纤维细胞, 并产生了稳定的iPS细胞[12],Zhu等人基于PB转座系统筛选出毕赤酵母的3个碳源代谢阻遏基因以及126个可能参与甲醇利用途径的功能基因[13]。TIS技术的发明扩展了以往转座子插入突变目标的局限,可见该技术具有着巨大的发展潜力和用途。

1.3 靶向核酸酶介导基因编辑技术

1.3.1 ZFN靶向基因敲除技术 锌指核酸酶(ZFN)是由锌指蛋白结构域与FokⅠ切割结构域融合而成的人工核酸酶。当两个ZFN单体各自与目标位点特异性结合且在DNA双链的距离和方向符合一定要求时,FokⅠ能够形成二聚体的活性形式,从而切割两个结合位点的间隔区,产生DNA双链切口,再利用细胞本身的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复,最终便可以达到基因敲除的目的[14]。

ZFN技术已成功应用在植物中的基因组修饰,且在果蝇、秀丽隐杆线虫和斑马鱼中已有研究。目前,还运用于小鼠研究中,对比于诱变与转座子插入突变而言,其特异性较强,工作量也更小[15]。但由于其特异性结合到不同的基因序列的过程需要较大的锌指蛋白,而锌指蛋白连接在一起时会相互干扰,导致容易出现脱靶的现象。因此,ZFN技术还具有较大的进步空间,如何降低其脱靶率是该技术重点突破方向。

1.3.2 TALEN靶向基因敲除技术 TALEN是由TALE与FokⅠ构成。它与ZFN相比,其识别序列不受位点上下游序列影响是作为第二代基因敲除技术的一个突出特点,但其作用原理与ZFN大致相同。其中,TALE蛋白是通常由串联的33～35个氨基酸组成,其除了第12、13个氨基酸位置高度可变(RVD)外,其他重复序列高度保守。因此在TALEN技术中RVD就起到了碱基特异性识别的功能。而FokⅠ核酸内切酶则负责制造出切口,诱导DNA修复[16]。

该技术在成功应用于酵母后,便迅速运用在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼等研究中。如Y Tatsumi等通过TALEN介导的诱变获得了2种rspo2斑马鱼突变体,一种是缺乏所有功能结构域的空突变体,另一种是缺乏两个N末端结构域的亚态突变体,这两个突变体的获取有助于识别rspo2在骨骼发育过程中的作用[17]。Wang等通过TALEN介导的基因编辑破坏了小鼠的两个Y连锁基因(Sry和Uty),促进了对Y染色体基因功能的研究[18]。Wu等采用TALEN技术对猪的Tiki1进行定点修饰,成功构建了猪Tiki1敲除的大动物模型,为实现大动物高效的基因编辑提供了一定的技术基础[19]。此外,TALEN技术显著的缺点就是其模块组装的过程极其复杂,且具有一定的毒性。

1.3.3 CRISPR-Cas9基因敲除技术 CRISPR-Cas9技术是基于细菌与古生菌免疫防御机制所开发出的基因敲除技术。其使用被sgRNA激活的Cas9蛋白进行双链DNA位点切割,再由低保真度的修复使位点突变失活[20]。

ZFN与TALEN技术作为第一代和第二代技术,存在着识别率低、成本高、脱靶率高、设计复杂等缺点,相比之下,作为第三代基因敲除技术的CRISPR-Cas9技术只需要可编程RNA即可产生序列特异性,因此其更为方便,制作更为简单,脱靶率也有所降低。Zhou等通过胚胎共显微注射Cas9-mRNA和靶向小鼠B2m,Il2rg,Prf1,Prkdc和Rag1的多种sgRNA产生了不同种类的免疫缺陷小鼠品系[21]。Zhang等实现了用CRISPR-Cas9系统把人的293T细胞的PVALB、EMX1基因、小鼠的Th基因定点突变。CRISPR-Cas9系统也被证明在根茎农杆菌转化后的番茄毛根中起作用,并且是甜橙的第一个基因组编辑平台[22]。CRISPR-Cas9系统一出世便引起了一系列基因编辑热潮,直到现在仍未止步,相信伴随着众多对CRISPR-Cas9系统的改良运用,该技术将在基因功能验证的发展上继续发挥着巨大的作用。

2 RNA干扰技术

RNA干扰技术利用生物对未知病毒侵害、外源基因的固有防御机制,使用与靶基因序列具有同源性的双链RNA引发高效且具有特异性的对应mRNA降解的技术,属于转录后水平基因沉默[23]。由于siRNA与靶标mRNA的结合严格遵循碱基互补配对原则,因此具有极强的特异性,且其操作简单,周期短,抑制作用明显,在大量基因未知功能的验证上具有着极大的运用前景。在植物、秀丽隐杆线虫、果蝇等生物群中已有较为突出的成果,如Kamath等人已通过RNA干扰预测了秀丽隐杆线虫19427个基因中86%的功能[24]。Dietzl等人通过RNA干扰与二元GAL4/UAS系统生成了22270个转基因系,覆盖了果蝇88%的预测蛋白质编码基因[25]。另外,其作为遗传工具已广泛运用于哺乳动物的研究中,Beth Shafer等运用长dsRNA成功沉默了小鼠细胞的部分基因表达[26]。然而,在近年来在原核生物的研究中也发现了其存在RNA干扰机制,Man等人建立了atsRNA筛选模型,为研究原核生物的基因表达提供了一种新的工具[27]。

3 基因过表达技术

基因过表达技术是将目的基因的编码区构建到载体上,后导入细胞达到目的基因过量表达,从而观察表型分析目的基因的功能的技术。其中最重要的就是载体的构建,可以分为非病毒表达载体和病毒表达载体。由于选择不同的基因表达载体会影响到目的基因在细胞内的转染效率与稳定表达,所以在设计实验时,载体的选择需要慎重考虑[28]。

作为技术最成熟的基因功能验证技术之一,近年来在动植物生物群中运用较为广泛。Sun等构建了向日葵HaACO1的表达载体进行过表达分析,证明了其与植物耐盐性有关[29]。Zhou等对芝麻SiSAD基因进行了克隆与过表达分析,探究了其在油酸合成过程中的作用[30]。Jia等利用过表达技术建立了猪GHR基因显负性突变体的慢病毒载体,为后续研究相关基因功能筑造了基石[31]。在飞速发展的分子生物学时代,技术所展示的效率显得尤为重要,在今后的使用过程中,需要更为注重表达载体的构建,选择合适的启动子、增强子、多聚腺苷酸信号等元件,都能够提高目的基因在功能上的表达效率。

4 微阵列分析

微阵列分析是Schena等人首次开发的一种高通量检测基因表达的系统,是生物学发展史上的一座里程碑[32]。现今依据不同的作用对象,被分为DNA微阵列、蛋白质微阵列、染色体微阵列、组织微阵列等。微阵列具有体积微小、成本较低、分析快且可多个样品同时进行实验等优势,大大提高了基因功能验证的效率。近几年来,微阵列分析大量地运用于医疗疾病方面的基因功能检测,如Tian等利用DNA微阵列检测方法实现了对流感病毒的分类,简化了诊断程序[33]。Wang等运用染色体微阵列分析表明了胎儿染色体非整倍体的发生率与年龄密切相关,而染色体拷贝数变异发生率与年龄无关[34]。He等结合蛋白微阵列分析得出WNT5A和COL1A1可能在软骨损伤中起重要作用[35]。在使用过程中,蛋白质类微阵列虽然比DNA微阵列更为复杂,操作难度更大,但蛋白质作为基因最终表达的代表产物,其更加全面地反映基因的本质性功能。因此,改良蛋白质类微阵列分析方法对于微阵列分析的发展具有一定的重要性[36]。

5 基因诱捕技术

基因诱捕技术是一种将诱捕载体和小鼠胚胎干细胞(ES细胞)所结合的高通量基因突变方法。与传统的仅依靠生物体内同源重组突变基因相比,使用基因诱捕的无启动子基因诱捕载体的同源重组效率高了50%[37]。

该方法具有简单性和高效性,近几年来,主要运用于小鼠、斑马鱼、拟南芥。Kawakami提出了使用Tol2转座元件在斑马鱼中进行基因捕获的方法,为研究脊椎动物发育提供了新的思路[38]。Patricia通过基因诱捕证明了拟南芥中PRL与启动DNA复制的MCM2-3-4酵母基因家族相关[39]。David等使用基因诱捕技术证明了小鼠活力、生长和肺发育与Sulf2基因有关[40]。目前该技术主要受限的原因是使用范围较小,只能够去除ES细胞表达的基因,在近年来常与其他技术结合使用。

6 结论与展望

在生命科学爆炸式发展的时代,作为探究生命本质不可或缺的基因功能验证领域受到了更多的关注,其研究方法多种多样,各种技术也都具有着独特的优势。但目前看来,仍然存在着特异性不足,使用效率不高、脱靶率较高、通用性不强等问题,这些研究瓶颈仍需要我们对其分子机制进一步研究来打破,发展出更为高效的基因功能验证方法。尽管如此,现今的基因功能研究已在医疗、病虫害防治、改良作物等领域展露出不可替代的作用。同时,随着科学家们的不断探求,基因功能验证技术正在不断地被完善走向成熟,相信在今后的时代里,基因功能验证能够爆发出更多不可取代的价值。