褪黑素调控卵泡发育的研究进展

刘晶晶，李宗阳，刘丽梅，潘晓燕

1北华大学医学技术学院，吉林吉林 132013 2吉林医药学院生殖医学研究中心，吉林吉林 132013

卵泡是女性或雌性动物生育的基础，卵泡发育异常是导致女性或雌性动物不育的直接原因。目前已发现越来越多的因素会影响卵泡发育，如肥胖、衰老、环境、饮食和药物等均会不同程度地影响卵泡的生长发育，损伤卵泡细胞和卵母细胞中线粒体和内质网等重要细胞器，使细胞中过量活性氧积累，引起卵泡的凋亡和退化[1-2]。

褪黑素是由松果体分泌的吲哚胺，在正常生理状态下，褪黑素受明暗环境的交替调节，具有昼低夜高的分泌规律。松果体可将合成的褪黑素直接分泌进入血液循环，褪黑素可分布于人体的许多组织中，包括女性的生殖系统[3-4]。近年来研究发现，褪黑素不仅调控着人的睡眠周期，而且作为抗氧化剂，可直接清除卵巢组织中过量的活性氧，提高卵泡抗氧化酶活性；通过与卵巢组织中褪黑素受体(melatonin receptor，MT)1和MT2结合，调控环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环鸟苷酸合成和磷脂酶C活性，增强卵巢组织代谢功能，促进卵泡发育和卵母细胞成熟，增强胚胎发育能力和延缓卵巢衰老[5-6]。褪黑素改善卵母细胞发育质量，提高女性生育能力的作用越来越受到人们青睐和重视。

为使人们更深入地理解褪黑素在女性或雌性生殖过程中的重要作用，我们将从褪黑素对卵泡发育的作用机制和对卵泡功能的影响等方面展开论述，最后从缓解卵泡损伤的角度阐释褪黑素临床应用前景。

褪黑素对卵泡发育的作用机制

褪黑素的抗氧化作用在卵泡生长发育过程中，活性氧可促进细胞存活、增殖和分化，有益于维持卵巢和卵泡的正常生理功能；但过量活性氧积累则会引起细胞氧化应激，造成颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁和卵母细胞发育障碍[5]。卵泡液中存在着一定浓度的褪黑素，在临排卵前和排卵过程中褪黑素的浓度最高[6]，这与其缓解排卵过程中过量活性氧对卵母细胞和颗粒细胞的氧化应激损伤密切相关。褪黑素发挥抗氧化作用主要通过下面两条途径：(1)依靠自身的亲水性和亲脂性，自由通过细胞膜，直接清除卵泡中过量活性氧[6]；(2)通过与细胞膜上的受体结合，调节下游抗氧化信号通路，诱导多种抗氧化酶表达，减轻卵泡的氧化损伤[7]。

核因子E2相关因子2(nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2)/kelch样ECH相关蛋白-1/血红素加氧酶-1通路是细胞应对氧化应激的主要防御系统之一。褪黑素可通过与卵母细胞膜上特异性受体结合，激活Nrf2，进入细胞核，与细胞核中的抗氧化反应元件结合，促进卵母细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)1和血红素加氧酶-1产生，减少玻璃化冷冻引起的卵母细胞氧化应激损伤[8]。在猪卵丘-卵母细胞体外成熟期间，褪黑素和MT2结合，激活了Nrf2信号通路和过氧化物酶系，提高了过氧化氢酶(catalase，CAT)表达，清除了过量活性氧，显著提高了卵母细胞的成熟质量[9]。褪黑激素还能促进核结合位点视黄酸受体相关孤儿受体α表达，诱导CAT、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶启动子去甲基化，提高抗氧化酶表达，增强卵丘细胞的抗氧化能力[10]。

Nrf2：核因子E2相关因子2；MT1：褪黑素受体1型；MT2：褪黑素受体2型；Sirtuins：NAD +依赖性脱乙酰基酶；CAT：过氧化氢酶；SOD1：超氧化物歧化酶 1；HO-1：血红素加氧酶-1；ROS：活性氧；E2：雌二醇；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2蛋白；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bax：Bcl-2相关X蛋白；Bim：Bcl-2样蛋白；P4：孕酮；AMH：抗缪勒管激素；BMP-15：骨形态发生蛋白-15；MPF：成熟促进因子；GDF-9：生长分化因子-9；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

褪黑素可通过调控Sirtuins家族成员表达，缓解细胞氧化应激，哺乳动物Sirtuins家族包括沉默信息调节因子(silent information regulator，SIRT)1～SIRT7 7个亚型，其中SIRT1是细胞代谢和氧化应激的关键调控蛋白，在闭锁卵泡颗粒细胞和肥胖动物卵泡中的表达显著降低，与卵泡发育阻滞和卵泡储备减少密切相关[11-13]。褪黑激素可激活SIRT1信号通路，提高Nrf2、血红素加氧酶-1、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达，减少卵泡氧化应激和卵泡闭锁[14-16]，对卵巢早衰有明显的保护作用。SIRT3也是调控细胞内活性氧水平的重要蛋白，褪黑素可增强SIRT3活性，促进叉头框蛋白O3与CAT和SOD2启动子结合，提高CAT和SOD2表达，对衰老小鼠卵泡颗粒细胞具有明显的抗氧化作用[17]。褪黑素还可通过调控Sirtuins家族成员，在氧化损伤的卵母细胞中发挥着重要的抗氧化作用，褪黑素能促进肥胖小鼠卵母细胞SIRT3蛋白的表达，抗氧化酶SOD基因发生去乙酰化，增加了SOD表达，减少卵母细胞线粒体氧化损伤[18]。褪黑素也可促进衰老小鼠卵母细胞中SIRT2表达，降低组蛋白H4K16的乙酰化水平，显著缓解母体衰老引起的卵母细胞减数分裂缺陷[19]。

褪黑素具有亲水、亲脂特性，可在细胞膜、细胞核和线粒体等部位以高浓度形式聚集，缓解过量活性氧引起的颗粒细胞DNA 损伤、线粒体功能障碍和膜脂质过氧化，改善苯诺沙普和杀虫剂乐果诱导的卵母细胞减数分裂缺陷，维持老化卵母细胞与卵丘细胞之间的细胞交流[20-24]。总之，褪黑激素可通过多种途径发挥其抗氧化特性，对哺乳动物卵泡发育具有重要保护作用。

褪黑素的抗凋亡作用卵巢中的卵泡除了正常的凋亡外，在氧化损伤、毒素或激素的异常刺激下，会诱发并促进卵泡凋亡，导致卵巢早衰、不排卵等，引起女性不孕。褪黑素可调控抗凋亡因子和促凋亡因子表达，减少卵泡闭锁。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族在抑制卵母细胞、颗粒细胞凋亡以及卵泡闭锁中起着重要的调控作用[25]。褪黑素可提高卵泡颗粒细胞中Bcl-2和促黄体素受体(luteinizing hormone receptor，LHR)基因表达，抑制热应激条件下卵泡颗粒细胞凋亡[20]。褪黑素也可显著降低抗肿瘤药物环磷酰胺诱导的颗粒细胞中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和Bcl-2相关X蛋白表达，提高Bcl-2水平，显著抑制颗粒细胞凋亡[26]。褪黑素还能提高卵泡中自身受体蛋白表达，促进卵泡中Bcl-2产生，有效改善由顺铂诱导的卵巢氧化损伤和卵巢组织凋亡[27]。褪黑素在促进抗凋亡因子表达的同时，也会抑制促凋亡因子表达，并可促进促凋亡因子Bcl-2样蛋白 11泛素化，降低促凋亡蛋白表达，抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡[28]。

褪黑素可通过与受体结合来调节凋亡信号通路，对卵泡发挥抗凋亡作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路在调节卵泡颗粒细胞凋亡中起主要作用，褪黑激素可促进哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关基因表达，显著上调细胞周期蛋白D1和Bcl-2水平，降低凋亡相关因子细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3、肌球蛋白样Bcl-2 结合蛋白和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ表达，从而增强卵泡颗粒细胞增殖[29-30]。褪黑素也可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径促进叉头框蛋白O1的核输出与磷酸化，从而阻断自噬相关蛋白表达，抑制半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8/9激活，防止氧化应激时颗粒细胞自噬性死亡[31-32]。

褪黑素对卵泡功能的影响

褪黑素促进卵巢激素合成卵巢类固醇激素参与调控卵泡募集、发育和选择等生理过程，褪黑素可通过下丘脑-垂体-性腺轴调节促性腺激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生成素分泌，调控雌激素合成，影响卵泡生长发育。褪黑素可激活青春期小鼠垂体丝裂原活化蛋白激酶1/2 信号通路，增加卵泡中促卵泡素β和细胞色素P450 19家族A亚家族肽1基因表达，促进FSH和雌二醇合成[33]。褪黑素也可激活蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白信号通路，提高黄素化颗粒细胞中磷酸化cAMP反应元件结合蛋白、芳香化酶的表达和雌二醇分泌[34]。对卵巢过度刺激综合征的患者，褪黑素的抑制剂可显著降低卵泡中雌二醇水平，缓解卵巢过度刺激综合征发生[34]。排卵后，褪黑素可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，上调类固醇激素合成急性调节蛋白表达，促进黄素化颗粒细胞合成和分泌孕酮，提高女性受孕能力[35]。

褪黑素参与调控颗粒细胞产生抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)。颗粒细胞产生的AMH可抑制原始卵泡活化，降低卵泡对FSH的敏感性，从而维持卵巢中一定数量的原始卵泡和生长卵泡，防止原始卵泡过度耗尽[26]。抗肿瘤药物环磷酰胺会降低卵巢中AMH水平，促使原始卵泡过度激活，造成原始卵泡丢失和颗粒细胞凋亡，经褪黑素处理后，显著提高了卵巢AMH水平，对环磷酰胺诱导的原始卵泡丢失具有明显的保护作用[26]；褪黑素也可通过SIRT1信号通路提高卵巢中AMH水平，改善卵巢早衰，保护女性生育能力[16]。

褪黑素可提高卵巢中自身受体和促性腺激素受体的表达。在颗粒细胞的体外培养液中添加褪黑素，可显著增加颗粒细胞上MT1 和 MT2的表达，促进孕酮的合成和分泌，抑制颗粒细胞凋亡[36]。褪黑素可显著增加颗粒细胞中LHR表达水平，显著降低颗粒细胞上卵泡刺激素受体表达[37-38]。褪黑素还可以通过对自身受体和促性腺激素受体表达的调控，调节卵泡颗粒细胞的生长和发育。

褪黑素促进卵泡细胞因子和成熟促进因子分泌卵泡通过自分泌/旁分泌产生细胞因子骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-15和生长分化因子-9，参与调节颗粒细胞、卵母细胞和膜细胞的生长发育、分化和排卵等生理过程。BMP-15是卵泡生长黄素化的抑制因子，可降低腺苷酸环化酶的活性，下调FSH对卵泡的刺激，抑制孕酮合成[39]。褪黑素可通过Smad途径减弱BMP-6对孕酮合成的抑制作用，参与维持卵巢功能[39]。褪黑素可显著提高卵母细胞MT1表达，增加环鸟苷酸、BMP-15和生长分化因子-9的表达水平，促进卵母细胞体外成熟[40-41]。

褪黑素通过调控卵母细胞成熟促进因子表达，促进卵母细胞减数分裂恢复[42]。在卵母细胞成熟过程中，褪黑素可增加孕酮分泌，促进卵母细胞成熟促进因子合成和卵泡的破裂排卵[43]。在猪卵母细胞的体外培养液中添加褪黑素，可显著提高丝裂原激活蛋白激酶表达，上调卵母细胞中成熟促进因子水平，促进卵母细胞减数分裂恢复和卵母细胞体外成熟，提高卵母细胞的发育潜力[44]。

褪黑素促进颗粒细胞发育颗粒细胞是卵泡的主要功能细胞，可合成类固醇激素和多种生长因子，为卵母细胞生长发育和成熟提供良好的微环境。褪黑素可降低颗粒细胞中抑制素α、抑制素βB 、FSH受体和转化生长因子β受体3的表达，下调颗粒细胞中抑制素β和激活素B的丰度，降低颗粒细胞对FSH刺激的敏感度，同时提高颗粒细胞中LHR和抑制素βA的表达，增加颗粒细胞对孕酮的分泌，促进颗粒细胞分化[45]。褪黑素也可促进G蛋白偶联雌激素受体1和抗增殖蛋白2表达，使得颗粒细胞周期停滞，避免颗粒细胞过早分化，同时也可通过延缓线粒体蛋白合成，使窦卵泡颗粒细胞处于缓慢生长阶段[46-47]。褪黑素还可调控细胞基质受体和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，影响血管形成和黄体细胞外基质重塑，调节颗粒细胞黄素化[48]。褪黑素也可上调B淋巴细胞瘤超大型蛋白、Bcl-2、谷胱甘肽过氧化物酶4和SOD1蛋白的表达，降低半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3、Bcl-2相关X蛋白和肿瘤蛋白53的表达，抑制颗粒细胞凋亡[45]。由此可见，褪黑素通过多种途径调控着卵巢颗粒细胞的生长发育、增殖分化和凋亡。

褪黑素促进卵母细胞成熟在卵母细胞减数分裂过程中，核小体间相互作用、染色体分离等都受到组蛋白乙酰化修饰的调控[49]。在自然衰老的小鼠中，乙酰化组蛋白H4K16过表达会引起卵母细胞减数分裂缺陷，褪黑素可通过提高去乙酰化酶SIRT2表达而降低H4K16的乙酰化水平，减少与母体衰老相关的卵母细胞减数分裂缺陷，显著提高老化卵母细胞的成熟质量[49]。褪黑素与卵母细胞上 MT1结合，可提高卵丘细胞扩展相关基因透明质酸合成酶1和穿透素3表达水平，促进卵丘细胞扩展，增加表皮生长因子受体和LHR表达，促进卵母细胞减数分裂的关键基因减数分裂阻滞蛋白1表达，提高卵母细胞的成熟率[41，50-51]。

褪黑素可参与调控卵母细胞中cAMP水平，从而促进卵母细胞减数分裂恢复和卵母细胞成熟[52]。网格蛋白介导的内吞作用也参与调节cAMP的表达，抑制网格蛋白介导的内吞作用可提高cAMP水平，抑制卵母细胞成熟[53]。褪黑素可促进卵母细胞中网格蛋白介导的内吞作用相关蛋白网格蛋白轻链B、动力蛋白2和衔接蛋白2的表达，降低cAMP水平，促进卵母细胞成熟[52]。褪黑素也可通过MT1介导，降低卵母细胞中cAMP 水平，恢复卵母细胞减数分裂，促进核成熟[54]。有趣的是，褪黑素具有提高体外成熟卵母细胞产生的早期胚胎发育能力，而对体内成熟卵母细胞产生的胚胎作用却不明显，说明目前卵母细胞的体外成熟条件还不完善，褪黑素可能成为保护卵母细胞体外发育的重要添加物[55]。

褪黑素对临床卵巢卵泡损伤的治疗潜能

环境、药物、疾病和衰老等因素可引起卵巢/卵泡损伤，进而影响女性或雌性动物的生育。褪黑素作为一种内源性分泌激素，在睾丸、卵巢和子宫上均存在结合位点，对生殖活动具有重要的调控作用[37]。临床上，卵胞浆内单精子注射患者在取卵前3个月口服肌醇和褪黑素，卵胞浆内单精子注射后再连续口服褪黑素和维生素D 3个月，可显著改善患者卵母细胞和囊胚的质量，提高临床妊娠率[56]。对反复产生低质量胚胎患者，获取卵母细胞体外受精后，在培养液中添加褪黑素，培养5～7 d，可显著提高患者卵裂第3天高质量胚胎的发育率、可移植囊胚的发育率和临床妊娠率[57]。在冷冻解冻后的卵裂第3天胚胎的培养液中添加褪黑素，培养3 d，可显著提高冷冻解冻后卵裂胚的囊胚发育率[57]。卵巢储备功能下降的患者，从取卵前1个月经周期的第5天开始，每天晚上口服褪黑素，一直服用到取卵，可显著增加取卵时患者体内的雌激素水平和减数分裂Ⅱ的中期卵母细胞获得率[58]。

在辅助生殖技术领域，褪黑素可以保护卵母细胞和颗粒细胞的正常发育，减轻卵母细胞纺锤体和染色体异常，缓解冷冻保存带来的卵母细胞和胚胎发育损伤，提高妊娠率。褪黑素在临床上为多囊卵巢综合征患者、卵巢储备功能下降患者和体外受精反复失败患者提供了一种潜在的拯救策略，为广大不孕症患者带来了新的希望[59]。

小 结

褪黑素对卵泡发挥着抗氧化、抗凋亡和激活促卵泡生长发育的信号通路的作用，调控着卵泡生长、发育和闭锁等重要生理过程(图1)。褪黑素不仅能促进卵母细胞成熟，也能通过表观遗传的调控机制保证核成熟的质量，减少减数分裂异常发生。在辅助生殖技术领域，外源性褪黑素补充剂能保护卵泡生长发育，改善卵母细胞质量，增加受精率和优质胚胎的数量，提高女性妊娠率。随着褪黑素在生殖调控分子机制研究的不断深入，将会进一步推动褪黑素临床的广泛使用，为广大不孕不育症女性患者带来新的福音。