川陈皮素调节CCL2-CCR2信号轴对牙周炎大鼠炎性损伤的影响

喻锦娴, 俞 梅, 李 娜

(湖北省武汉市中医医院口腔科, 湖北 武汉 430000)

牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病,其特征是牙槽骨缺失和牙齿松动[1],如果不及时治疗,将最终导致牙齿脱落。目前常通过清除牙菌斑,药物消除牙龈炎症对牙周炎进行干预,常用抗生素消除炎症,然而抗生素长期使用会产生耐药性[2],为了解决此问题,中药因副作用相对较小走进人们视野。川陈皮素是一种多甲氧基黄酮,具有抗炎、抗氧化、抗病毒功能,据报道,川陈皮素可抑制白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的人牙周韧带细胞中的炎症反应[3]。但川陈皮素对体内牙周炎模型的研究尚未见报道。趋化因子在炎症过程中至关重要,它们可使免疫炎症细胞充分募集到微生物感染部位,例如牙龈。然而,在C-C趋化因子配体2(C-C Chemokine ligand 2,CCL2)等趋化因子的调节下,大量免疫细胞聚集在炎症部位,导致炎症反应持续放大,因此CCL2已成为包括牙周炎在内的炎症性疾病的治疗靶点[4]。有研究表明与牙周健康部位相比,人和大鼠牙周炎部位的牙龈中发现更高水平的CCL2[5]。因此,抑制CCL2表达有可能为牙周炎治疗提供新的思路。本文通过构建牙周炎大鼠研究川陈皮素在牙周炎大鼠中发挥的抗炎作用及其可能机制,以期为牙周炎的治疗提供实验参考。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级雄性SD大鼠50只,体重(200±20)g,购自三峡大学(许可证号SCXK(鄂)2022—0012)。大鼠饲养温度在18～24℃,相对湿度在40%～70%,每日光照12h,不限饮水,定时供给普通饲料。本研究经武汉市中医医院动物伦理委员会审核批准(批准号20220315)。

1.2主要试剂:川陈皮素(纯度>98%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司;苏木素伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒购自碧云天公司;DAB显色剂购自中衫金桥;Anti-CCL2抗体购自Abcam公司;C-C趋化因子受体2(C-C Chemokine acceptor 2,CCR2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、β-actin抗体购自CST公司。

1.3方 法

1.3.1牙周炎大鼠模型建立:采用丝线结扎联合10%蔗糖饮水建立牙周炎模型:戊巴比妥钠将大鼠进行麻醉并将大鼠固定好,在大鼠上颌左边第二和三磨牙间穿过3-0的丝线,结扎第二磨牙,并将大鼠饮水换为10%蔗糖水溶液,每天检查结扎是否在原位置,如果发现脱落应重新及时结扎,4周后观察大鼠出现牙齿松动、牙龈红肿出血和牙槽骨吸收现象,表明牙周炎大鼠模型构建成功。

1.3.2分组:将50只大鼠分为对照组、模型组、川陈皮素低剂量组、川陈皮素中剂量组、川陈皮素高剂量组,每组10只。除对照组外,其他4组建立牙周炎模型。造模成功后开始给药,川陈皮素低剂量组、川陈皮素中剂量组、川陈皮素高剂量组每天分别灌胃25、50、100mg/kg川陈皮素;对照组、模型组每天灌胃等量生理盐水。

1.3.3HE染色检测各组大鼠牙周组织病理形态变化:灌胃结束后,取各组大鼠上颌组织,PBS漂洗后固定于10%甲醛中,48h后进行脱钙处理,1个月后进行石蜡切片,HE染色,观察牙周组织病理形态变化,包括炎性细胞浸润以及牙槽骨吸收情况。

1.3.4免疫组织化学染色检测各组大鼠牙周组织CCL2表达:取石蜡切片,抗原修复,滴加3%双氧水溶液,山羊血清封闭,加入一抗CCL2(1∶100),4℃下过夜孵育,加入HRP标记二抗(1∶200),37℃下孵育1h,DAB显色,苏木素复染,封片,光镜下观察拍照,CCL2阳性染色为棕黄色。

1.3.5qPCR检测各组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平:Trizol裂解各组大鼠牙周组织,提取细胞总RNA,将RNA反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达,内参为β-actin。引物如下:CCL2正向5'-AAACCAGCCAACTCTCACT-3';反向5'-GTAGTTCTCCAGCCGACTC-3'。CCR2正向5'-TGTGAAGCAAATTGGAGCTTGG-3';反向5'-GAATGGGAGTGTGAGCAGGAA-3'。TNF-α正向5'-TCTTCTCATTCCTGCTCGTG-3';反向5'-GAGGCTGACTTTCTCCTGGT-3'。IL-1β正向5'-CTATGTCTTGCCCGTGGAG-3';反向5'-CTGCTTGAGAGGTGCTGATG-3'。IL-6正向5'-CCACTGCCTTCCCTCTTCA-3';反向5'-TCTTGGTCCTTAGCCACTCC-3'。β-actin正向5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3';反向5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用2-ΔΔCT计算CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的相对表达量。

1.3.6Western blot检测各组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达:RIPA裂解各组大鼠牙周组织,提取蛋白,将蛋白定量后进行Western blot检测CCL2、CCR2蛋白水平,操作如下:SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,脱脂乳封闭,4℃过夜孵育一抗CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6(均1∶1000稀释),室温孵育二抗(1∶2000)1h,ECL将膜显色,凝胶成像系统保留图像,Image J软件分析蛋白灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠牙周组织病理形态比较:对照组牙周组织结构正常,未见明显病理损伤;与对照组相比,模型组大鼠牙周组织出现牙槽骨吸收,有大量炎性细胞浸润;与模型组相比,川陈皮素低、中、高剂量组大鼠牙周组织炎性细胞浸润逐渐减轻,成纤维细胞数量逐渐增加,见图1。

图1 HE染色检测各组大鼠牙周组织病理形态(100×)

2.2各组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平比较:与对照组相比,模型组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,川陈皮素低、中、高剂量组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平显著降低(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠牙周组织CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6 mRNA水平比较

2.3各组大鼠牙周组织CCL2表达比较:免疫组化染色结果显示,CCL2阳性染色为胞质内呈现棕黄色或棕色颗粒,上皮细胞及成纤维细胞中均可见CCL2阳性表达。与对照组相比,模型组大鼠牙周组织CCL2阳性细胞数目增多;与模型组相比,川陈皮素低、中、高剂量组大鼠牙周组织CCL2阳性细胞数目减少,见图2和表2。

图2 免疫组化染色检测CCL2在大鼠牙周组织中的表达(200×)

表2 各组大鼠牙周组织CCL2表达比较

2.4各组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达:与对照组相比,模型组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,川陈皮素低、中、高剂量组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平显著降低(P<0.05),见图3和表3。

图3 Western blot检测各组大鼠牙周组织CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达

表3 各组大鼠牙周组织CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6蛋白水平比较

3 讨 论

慢性牙周炎是最常见的口腔疾病之一,会导致牙周组织发炎,包括牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨[1]。药物治疗常用抗生素,然而过量或长期使用抗生素可能导致抗生素耐药性。因此,本研究通过构建牙周炎大鼠模型,以探究开发新的有效药物。

近年来,中医因其副作用相对较小已逐渐被用作替代疗法,比如鱼腥草已被证明可以预防口腔传染病[6]。川陈皮素是从中药陈皮中提取的一类黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗真菌等功效。Hosokawa等[3]首次证明川陈皮素在人牙周韧带细胞发挥抗炎作用,可显著抑制IL-1β诱导的炎症反应,认为川陈皮素可能是治疗牙周病的潜在药物。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎症反应中常见的炎症因子,在牙周炎进程中发挥重要促进作用[7]。在本研究中,模型大鼠牙周组织出现牙槽骨吸收、大量炎性细胞浸润,牙周组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,表明牙周组织出现严重炎症反应,而川陈皮素干预后,模型大鼠牙周组织炎性细胞浸润逐渐减轻,牙周组织炎性因子水平降低,表明川陈皮素可减轻牙周炎大鼠炎症损伤。

CCL2是一种C-C型趋化因子,能够趋化和激活单核/巨噬细胞、淋巴细胞等,从而参与炎症与免疫反应[8]。在牙周炎中,CCL2促进单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的募集,免疫细胞位于受损牙龈处形成防线[9]。但造成牙周组织持续性破坏的原因之一,也是产生可以趋化淋巴细胞和单核细胞进入炎症组织的趋化因子,有研究表明降低CCL2表达可减少炎症细胞在牙周组织聚集,从而抑制牙周组织破坏[10]。本文发现牙周炎大鼠CCL2阳性细胞数目增多,牙周组织CCL2、CCR2水平显著升高,提示抑制CCL2表达有可能是治疗牙周炎的潜在策略。给予川陈皮素干预后,牙周炎大鼠牙周组织CCL2阳性细胞数目减少,CCL2、CCR2水平降低,表明川陈皮素可能通过抑制CCL2-CCR2信号轴减轻牙周炎大鼠炎性损伤。

综上所述,川陈皮素可能通过抑制CCL2-CCR2信号轴减轻牙周炎大鼠炎性损伤,为治疗牙周炎提供新的思路,但其作用机制仍需进一步探索。在未来的研究中课题组将结合体外细胞实验对CCL2-CCR2信号轴进行干预,深入验证川陈皮素抗牙周炎的作用与机制。