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血清外周miRNAs差异表达在脊柱结核中的临床意义

2024-01-07付海平郇颜强阿拉木苏

河北医学 2023年12期
关键词:诊断模型结核脊柱

付海平, 王 飞, 郇颜强, 阿拉木苏

(内蒙古自治区人民医院/内蒙古大学人民医院脊柱外科, 内蒙古 呼和浩特 010017)

目前,结核病仍然是我国的常见病,每年有近1000万新发病例,其中约2%涉及脊柱[1]。中晚期脊柱结核常伴有严重的后凸畸形,并可能因脊髓受压而导致瘫痪。如果脊柱结核能够在早期得到诊断,并及时给予定期和足够的抗结核药物治疗,则可以阻止这种疾病的进展。目前,医生对脊柱结核的诊断仍主要通过影像学检查和对临床表现的经验认知来实现。由于脊柱结核在临床和影像学表现上与其他脊柱感染性疾病非常相似,因此准确诊断脊柱结核具有挑战性。近年来,诊断生物标志物的研究取得了重大进展。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是小的非编码RNA,根据与信使RNA(mRNA)的碱基配对,介导mRNA切割、翻译抑制或mRNA去稳定化。miRNAs表达的改变和随后其靶基因的失调已被证明参与结核的病理生理学。miRNAs除了在细胞内表达,还以稳定的形式存在于体液中,不受内源性RNA酶活性的影响。因此,细胞外miRNAs可能是一种多功能的通讯工具,它们在体液中的可及性或在组织中的表达特征使它们成为潜在的临床生物标志物[2]。本研究的目的是确定与健康对照相比,脊柱结核患者外周血中差异表达的miRNA,并确定这些miRNA在脊柱结核临床诊断中的潜在意义。

1 材料与方法

1.1一般资料:自2020年5月至2023年5月,纳入本院脊柱骨科收治的50例脊柱结核患者(实验组)和30例健康体检者(对照组)为研究对象。其中实验组男性25例,女性25例,年龄18~77岁,平均年龄(50.47±16.33岁),对照组男性13例,女性17例,年龄40~72岁,平均年龄(52.39±9.67)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究的实验方案经本院伦理委员会审查批准(编号:201913H6Z)。脊柱结核患者的纳入标准:①临床症状(如:盗汗、背痛、乏力等)、实验室和影像学检查综合诊断为脊柱结核患者;②纳入研究前未进行抗结核治疗;③近期未服用激素或免疫抑制药物。排除标准:①糖尿病、恶性肿瘤及其他感染性疾病患者;②近期用药可能引起血常规值变化的患者;③处于月经周期的妇女;④布鲁氏菌病等化脓性感染和腰椎病变患者;⑤资料不全或拒绝参与调查研究的参与者。健康人群纳入标准:①既往健康,无高血压等慢性疾病,无糖尿病、恶性肿瘤、结核病病史,近1个月内未服用免疫激活或抑制药物;②近两周内无病毒和细菌感染史;③体检无异常表现。排除标准:①有活动性肺结核、糖尿病、恶性肿瘤、感染性疾病;②近期服用可能导致血常规值变化的药物;③处于月经周期的女性;④免疫缺陷疾病或其他免疫系统疾病;⑤参与者信息不完整或拒绝参与调查。

1.2RNA分离和miRNAs图谱:在入院后的第2天早晨,从所有受试者的肘静脉抽取10mL血液,并置于EDTA试管中。在冰箱中于4℃静置30min后,静脉血以2500rpm离心5min。使用移液管轻轻提取澄清的上清液(即血浆),然后放入2mL不含酶的冷冻保存管中。立即分离血浆中的miRNAs。使用TRIzol-LS(美国Invitrogen公司)收获总RNA。在使用NanoDrop 1000通过RNA数量测量后,使用miRCURY Hy3/Hy5 Power labeling kit(美国Exiqon公司)标记样品,并在miRCURY LNA阵列(v.18.0)(美国Exiqon公司)上杂交。在清洗步骤之后,使用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪(美国Axon Instruments公司)收集数据。然后将扫描的图像导入GenePix Pro6.0软件(美国Axon Instruments公司)进行网格对齐和数据提取。对复制的miRNAs进行平均,并选择所有样品中强度≥ 30的miRNAs用于计算归一化因子。标准化后,通过Benjamin Hochberg (BH)将校正P值(q值)设为q<0.1,将log2倍数变化(FC)的绝对值设为>2,鉴定出两组间显著差异表达的miRNAs。最后,进行系统聚类以显示样品中可区分的miRNA表达谱。

1.3反转录和定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证血清中选定的miRNAs:使用TRIzol-LS从250μL血清中分离总RNA。在RNA分离过程中加入秀丽隐杆线虫合成miRNA-39-5p(cel-miR-39-5p),用作内部对照。使用miScript Ⅱ RT试剂盒(美国Qiagen公司)将100ng总RNA进行逆转录。在ABI 7900实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)上使用All-in-One qPCR试剂盒(美国GeneCopoeia公司)对选择的差异表达的miRNAs进行相对定量。使用2-△CT方法计算miRNA的相对表达水平,该方法将每个miRNA相对于cel-miR-39-5p水平的miRNA表达值标准化。然后从cel-miR-39-5p的Ct值中减去每个miRNA的重复分析的Ct值,得到用于进一步分析的△Ct值。引物购自美国GeneCopoeia公司。

1.4统计分析:使用SPSS24.0和GraphPad Prism 9.0进行所有统计分析。采用D'Agostino-Pearson算法进行数据分布正态性检验。使用卡方检验比较分类变量数据组,和Kruskal-Wallis检验或t检验比较连续数据组。多变量logistic回归方法建立诊断模型计算预测值,Youden's J指数确定最佳分类阈值。相关性通过Spearman相关分析进行评估。双侧P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1脊柱结核患者和健康人群血清中的MicroRNA微阵列分析:使用miRCURYTM LNA阵列(v.18.0)在10例实验组患者和10例对照组健康人群中筛选miRNAs表达谱。与健康人群相比,在脊柱结核患者血清中发现288种miRNAs差异表达(123种上调,165种下调)(倍数变化>2,P<0.05)。图1显示了健康人群和脊柱结核患者的差异表达miRNAs中前20个上调和下调miRNAs。

图1 健康人群和脊柱结核患者的差异表达miRNAs中前20个上调和下调miRNAs。

2.2脊柱结核患者和健康人群血清样本中差异表达miRNAs的验证:我们通过RT-qPCR在研究队列中验证了10个选择的miRNAs的表达水平,包括5个上调的miRNAs(hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-3960、hsa-miR-4722-3p、hsa-miR-5701)和5个下调的miRNAs(hsa-miR-493-3p、hsa-miR-4503、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-4796-5p、hsa-miR-323b-3p)。与对照组相比,实验组血清样本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平显著上调(P<0.05),hsa-miR-493-3p水平显著下调(P<0.05)(图2)。

图2 脊柱结核患者和健康人群血清样本中差异表达miRNAs的验证

2.3在研究队列中选择的候选性miRNAs对脊柱结核的诊断性能:随后,研究选择hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-493-3p用于构建基于miRNAs的脊柱结核诊断模型(STB模型)。基于3个选择的miRNAs的表达水平作为变量,建立的多元logistic回归模型如下:0.582+1.055×(hsa-miR-4708-3p)+0.811×(hsa-miR-5100)-0.970×(hsa-miR-493-3p)。与对照组相比,实验组STB模型评分显著升高(0.32±0.04vs0.65±0.08,t=6.09,P<0.001)(图3A)。为了解释和评估生物标志物,通过Youden的J指数场确定最佳阈值。当临界值设置为0.46时,STB模型鉴别脊柱结核的ROC曲线下面积(AUC)为0.911,灵敏度为88.9%,特异度为77.0%(图3B)。

图3 基于miRNAs的脊柱结核诊断模型(STB模型)的诊断性能分析

2.4实验室测试的结果:在实验检查指标中,比较了对照组和实验组患者的实验室测试结果,发现两组在年龄、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等方面无统计学差异。然而,实验组患者的红细胞沉降率和CRP测定值显著高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 对照组和实验组的实验室测试结果比较

2.5STB模型的临床诊断分析:在实验组中,根据实验室测试结果异常和正常划分,比较STB模型的分布差异。结果显示,CRP和红细胞沉降率异常的脊柱结核患者的STB模型评分显著高于CRP和红细胞沉降率正常的脊柱结核患者(P<0.05),见表2。相关性分析显示,STB模型评分与CRP、红细胞沉降率呈显著正相关(r=0.633、0.499,均P<0.001)(图4)。

表2 STB模型在实验组临床表型中的分布

图4 STB模型评分与CRP(A)、红细胞沉降率(B)的相关性分析

3 讨 论

脊柱结核是肺外结核病的一种常见形式,由结核分枝杆菌引起,通过循环系统扩散并局限于骨的血管,导致破坏性骨和关节疾病的发生[3]。早期症状、临床表现不典型以及病程隐匿是脊柱结核治疗不及时和严重并发症的主要原因。因此早期诊断对脊柱结核的治疗和预后具有重要意义。由于缺乏特异、敏感的诊断指标,导致脊柱结核患者诊治延误。先前大量研究已经证明了血清、血浆或尿液中存在大量miRNA,并且这些miRNA水平可以用作各种疾病的生物标志物。在本研究中,我们通过MicroRNA微阵列分析发现在脊柱结核患者与健康对照中存在许多血清差异表达miRNAs。与对照组相比,实验组血清样本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平显著上调,和hsa-miR-493-3p水平显著下调。此外,基于这3个选择的miRNAs的表达水平建立的STB模型具有较好的脊柱结核诊断性能。这些结果表明,血清hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p可能是脊柱结核的潜在生物标志物。

近年来,随着高通量检测技术的进步,学者们研究了各种感染性疾病患者的miRNA表达,并取得了许多可喜的成果[4]。Wang等[5]在结核病患者血清中发现92个差异表达的miRNAs,其中59个上调,23个下调。Alipoor等[6]发现结核患者血清外泌体中miR-484、miR-425和miR-96的表达水平显著增加。还有研究发现,miR-223、miR-197、let-7和miR-320不仅可以指示感染患者,还可以识别耐药患者[7]。然而,目前较少关于脊柱结核患者循环miRNAs的发现和验证的研究。Yang等证实了血浆miRNA-155的表达及其在脊柱结核导致椎间盘破坏的发病机制中的作用[8]。在目前的研究中,我们使用高通量阵列平台在脊柱结核患者和正常健康人群的血浆样品中发现了候选miRNAs。通过qRT-PCR在大样本队列中验证候选miRNAs,并确定了hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p存在差异表达,这与以前研究中的miRNAs不同。我们认为脊柱结核的发病部位不同于肺结核;在发病过程中,参与骨感染、骨形成和骨破坏的病理生理过程的miRNAs会在血管中渗入血液,引起血浆中循环miRNAs表达的变化。此外,这还可能与不同的样本来源和大小有关。

先前的研究表明,hsa-miR-4708-3p调节人间质基质细胞的成脂分化[9]。miR-5100过表达已显示通过靶向PODXL降低胰腺癌细胞的侵袭性表型。miR-5100可以靶向并调节AMPK-mTOR信号通路的必需蛋白Dickkopf 1和Smad 7,进而增加胃癌细胞的侵袭性表型[10]。Kisan等[11]发现hsa-miR-493-3p可以通过介导YTHDF调节骨稳态。然而,这些miRNAs在脊柱结核发病机制中的作用尚未见报道。在目前的研究中,我们基于这三个选定的生物标志物开发了一个STB特异性诊断模型。性能分析表明,包含三个miRNA生物特征的诊断模型表现出诊断脊柱结核的高准确性。此外,我们进一步分析了诊断模型与患者临床特征的相关性,发现模型评分与红细胞沉降率和CRP水平呈正相关。众所周知,红细胞沉降率和CRP是评估脊柱结核患者的重要检测指标。因此,本研究建立的脊柱结核诊断模型满足作为诊断标记的要求。

总之,本研究发现hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p在脊柱结核患者外周血中有稳定的差异表达,包含这三种miRNAs的诊断模型具有较好的脊柱结核诊断性能。然而,目前关于这3种miRNAs在脊柱结核发病相关机制中的作用尚不清楚,需要进一步开展机制研究。此外,由于这项研究收集的样本量相对较小,本研究开发的STB模型需要通过扩大样本进行验证。

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