甘草酸苷对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的保护作用

史莉萍 李 文 林沁华

（赣南卫生健康职业学院药学系，江西 赣州，341000）

对乙酰氨基酚是广泛应用于解热镇痛的一大类非甾体类抗炎药， 但对乙酰氨基酚的中间代谢产物N-乙酰苯醌亚胺（N-acetyl-1，4-benzoquinoneimine，NAPQI）具有肝细胞毒性[1]。因患者不遵医嘱、误服或者过量服用等，可造成急性肝损伤（acute liver injury，ALI）甚至肝衰竭，且由对乙酰氨基酚引发的ALI 呈上升趋势。对乙酰氨基酚已成为导致药物性肝损伤最常见的药物之一，并成为欧美等发达国家引起急性肝衰竭的首要因素[2]。但是目前临床上用于治疗对乙酰氨基酚所致ALI 的有效药物和措施不多，且公认的解毒药N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）具有一系列不良反应[3-5]。因此，寻找理想的肝保护药物，降低对乙酰氨基酚在使用中的肝脏毒性具有重要的临床意义。甘草是豆科植物甘草的根及块状茎，是一种常见的中药，有清热解毒、补脾益气、镇咳怯痰的作用，而甘草酸苷为其主要活性成分之一。现代研究表明甘草酸苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、保护肝脏的作用[6-7]。已有学者研究提示甘草酸苷对对乙酰氨基酚介导的肝损伤具有保护作用[8-9]，但其作用机制仍有待深入探讨。因此，本研究通过实验验证甘草酸苷对对乙酰氨基酚所致ALI 小鼠的肝脏保护作用并探讨其具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康昆明种雌性小鼠24 只、雄性小鼠24 只，SPF 级，体质量25～35 g，中山大学中山医学院实验动物中心提供。实验期间均遵守本单位实验动物中心的管理规范照料和使用原则。

1.2 药品与试剂

对乙酰氨基酚注射液（生产企业：合肥中龙神力动物药业有限公司，兽药字120152532，规格10 mL:1 g），取适量对乙酰氨基酚溶于少量氯化钠溶液，然后补足氯化钠溶液配制成400 mg/mL 溶液备用[10]；注射用甘草酸苷（ 生产企业：瑞阳制药有限公司，国药准字H20060537）；联苯双酯（生产企业：浙江海翔川南药业有限公司，国药准字H20153110）。药用级橄榄油（生产企业：通化德济参药业有限公司，规格：500 mL/瓶）；0.9%氯化钠溶液、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）测试盒（赖氏法）（规格：96T）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）测试盒（微板法）（规格：96T）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测试盒（微板法）（规格：96T）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）测试盒（规格：96T）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）测试盒（规格：96T）、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（微板法）（规格：96T）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（羟胺法）（规格：100管/96 样）、丙二醛(A)测定试剂盒(TBA 法)（规格：100 管/96样）；免疫组化用苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染液（规格：50ml*2）（生产企业：南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 主要设备与仪器

医用离心机（生产企业：湖南赫西仪器装备有限公司，型号：DD5 型）；酶标仪（生产企业：南昌普朗医用设备有限公司，型号：DNM-9602 型）；自动脱水仪（生产企业：北京中瑞祥科技有限公司，型号：ZRX-29768 型）；石蜡切片机（生产企业：美国Thermo Fisher Scientific 公司，型号：HM340E 型）；光学显微镜（生产企业：日本Olympus 株式会社，型号：CX43型）；蛋白质凝胶电泳仪（生产企业：北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-24DN 型）。

1.4 建模、分组给药与实验动物处理

对乙酰氨基酚腹腔注射建立ALI 小鼠模型，质量浓度400 mg/mL、剂量1 mL/100 g 小鼠体质量，其中对乙酰氨基酚配置方法：取适量对乙酰氨基酚溶于少量氯化钠溶液，然后补足氯化钠溶液，使质量终浓度为400 mg/mL[10]。将造模成功的小鼠采用随机数表法分为模型组、联苯双酯组、甘草酸苷低剂量组、甘草酸苷中剂量组、甘草酸苷高剂量组，另设置对照组（建模时对照组仅腹腔注射1mL/100 g 小鼠体质量的氯化钠溶液），各8 只。联苯双酯组予以60 mg/kg 联苯双酯灌胃，甘草酸苷低、中、高剂量组分别予以50、100、150 mg/mL甘草酸苷灌胃（剂量均为1 mL/100 g 小鼠体质量，其中甘草酸苷低剂量组为临床等效剂量，甘草酸苷中剂量组为临床等效剂量×2，甘草酸苷高剂量组为临床等效剂量×4），联苯双酯和甘草酸苷均以四氯化碳橄榄油为溶剂。给药24 h 后取眼眶静脉血，后颈椎脱臼法处死，迅速剥离肝脏组织。血样用于检测肝功能、炎性反应指标；肝脏组织用于肝脏病理观察。

1.5 肝功能指标及炎症指标检测

将小鼠血液样本以4 000 r/min 离心10 min 分离血清。按照试剂盒说明书，酶标仪检测各孔吸光光度值，根据标准曲线计算各组血清ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6 水平。

1.6 肝组织病理变化观察

取各组小鼠左肝叶肝脏组织，制成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 组织块，采用10%甲醛溶液固定。24 h 后自动脱水仪脱水，后石蜡包埋、切片（层厚5 μm）。恒温烤干，以二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，采用HE 染色。于光学显微镜下观察并拍照。

1.7 肝组织氧化应激测定

取各组小鼠肝组织，冰上匀浆，加入0.9 %氯化钠溶液，3 000 r/min 离心10 min，取上清。按照试剂盒说明书，测定肝组织GSH、SOD。

1.8 统计学分析

采用SPSS 25.0 对所得数据进行统计学分析。计量资料经检验均符合正态分布，采用（±s）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，比较采用t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联苯双酯和甘草酸苷对小鼠肝功能的影响

与对照组比较，模型组血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和甘草酸苷低、中、高剂量组血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05）；与联苯双酯组比较，甘草酸苷低剂量组血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高剂量组血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05），见图1。

图1 各组小鼠血清肝酶浓度

2.2 联苯双酯和甘草酸苷对小鼠血清炎性因子的影响

与对照组比较，模型组血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和甘草酸苷低、中、高剂量组血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05）；与联苯双酯组比较，甘草酸苷低剂量组血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高剂量组血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05），见图2。

图2 各组小鼠炎症因子水平

2.3 联苯双酯和甘草酸苷对小鼠肝组织病理的影响

对照组中肝小叶结构完整，中央静脉形态完好，肝窦未见充血或扩张，肝细胞形态及排列正常，未见明显空泡样变和水样变，为0 级损伤。相较对照组，模型组小鼠肝组织HE染色切片有明显的肝小叶结构改变和肝索间隙扩张，中央静脉淤血，部分区域可观察到肝细胞脂肪样变、水样变等病理性改变，并伴有炎性反应细胞浸润，达到Ⅲ级肝损伤。与模型组相比，甘草酸苷低剂量组肝组织结构改变减轻，肝小叶形态变化减轻，中央静脉附近和肝细胞间有部分炎性反应细胞浸润；甘草酸苷中剂量组和联苯双酯组肝组织结构和肝小叶形态轻微改变，中央静脉附近和肝细胞间少有炎性反应细胞浸润；甘草酸苷高剂量组肝组织结构和肝小叶形态接近正常，中央静脉附近和肝细胞间基本没有炎性反应细胞浸润，未见肝细胞脂肪样变、水样变，见图3。

图3 小鼠肝组织HE 染色切片（×100）

2.4 联苯双酯和甘草酸苷对小鼠肝组织GSH、SOD 的影响

与对照组比较，模型组GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性升高（P<0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和甘草酸苷低、中、高剂量组GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性均降低（P<0.05）；与联苯双酯组比较，甘草酸苷低剂量组GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性均升高（P<0.05），甘草酸苷高剂量组GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性降低（P<0.05），见图4、5。

图4 各组小鼠肝组织GSH、SOD 活性

图5 各组小鼠肝组织MDA 活性

3 讨论

对乙酰氨基酚是临床常用的解热镇痛药之一，过量使用将导致其毒性代谢产物在体内蓄积，进而导致肝损伤甚至肝衰竭[11-13]。联苯双酯是目前常用的药物性肝损伤治疗药物，通过一定的抗氧化及免疫调节作用，达到促进肝细胞再生并保护肝细胞，增强肝脏解毒功能，减轻肝脏的病理损伤，减轻因四氯化碳及硫代乙酰胺引起的血清ALT 升高，改善肝功能的目的。因此本研究采用该药物作为阳性对照。目前，甘草酸苷主要用于治疗慢性肝病、改善肝功能异常[14]。有研究发现，甘草酸苷可以缓解雷公藤多苷所致的肝损伤[15]，其主要的机制包括减轻雷公藤多苷所致的细胞色素氧化酶CYP2B1的减少。本研究发现甘草酸苷对于对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤也有保护作用。组织学切片显示，对乙酰氨基酚所致肝损伤主要体现在肝细胞的脂肪变性和淋巴细胞的浸润。血清中升高的炎性反应指标，TNF-α 和IL-6 反映了对乙酰氨基酚导致的炎性反应水平的升高。免疫细胞浸润及一系列免疫反应的激活是肝损伤的一个重要环节[16-17]。研究显示，免疫浸润和炎性反应与肝细胞的凋亡坏死常相互伴行[18]。使用甘草酸苷后，肝细胞的损伤及免疫浸润水平明显减轻。

对乙酰氨基酚的毒性代谢产物导致肝损伤的重要机制是其引起细胞及组织内过度的氧化应激反应[19]，其通过耗竭胞内的还原型物质GSH，导致氧化反应无法被抗衡，进而产生一系列应激反应、线粒体功能紊乱及细胞死亡[20]。NAC 正是具有强大的抗氧化作用，是目前缓解对乙酰氨基酚最有效的药物。SOD 是细胞抗氧化体系的重要组成之一，而MDA是脂质过氧化的终产物，本研究结果显示，甘草酸苷可有效缓解对乙酰氨基酚导致的GSH 及SOD 活性降低，有望取代NAC 成为缓解对乙酰氨基酚引起的肝内氧化应激水平的临床药物[21-23]。

综上所述，甘草酸苷能够减轻对乙酰氨基酚诱导的ALI，对其肝功能有保护作用，且还可减轻炎性反应、氧化应激和肝组织病理改变。本研究为临床治疗对乙酰氨基酚诱导的ALI 提供了一种新的药物，但其是否具有其他作用机制、在临床中应用的有效性及安全性等仍需要进一步探讨，需作为后期的研究方向。