补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响*

刘 通，廖翔宇，陈玉宁，蒋 颖，陈琼君，熊 亮，邝伟川，文 希，刘 悦△

（1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510095；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095）

脑卒中严重危害人类健康和生命安全，其发病率高、病死率高、致残率高、复发率高。2019 年，发表于柳叶刀子刊《Lancet Neurology》的一项研究对1990 年至2019 年的204 个国家和地区进行了调查，调查结果显示：全球有1220 万中风发病病例，1.01亿中风患病病例，1.43亿伤残调整寿命年中风病例，以及655 万中风死亡病例。该结果表明：中风仍是世界第二大致死原因、第三大致残原因（按伤残调整生命年衡量）[1]。在我国，缺血性脑卒中在所有脑卒中患者中所占比例可高达85%，缺血性脑卒中幸存者中约有3/4 的患者遗留有不同程度的劳动能力丧失，给社会、家庭带来极大的负担[2-3]。因此，进一步探讨如何促进脑卒中后肢体功能障碍的康复仍是全球亟待解决的问题。

补气活血合剂（原名：中风复元合剂）是我院院内制剂，对治疗气虚痰瘀型缺血性脑卒中有显著的临床疗效[4-5]，然而其具体起效机制仍不明确。近期，有多项研究表明小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经干细胞等多种中枢神经系统细胞均能分泌外泌体，并调节神经系统疾病的发生和发展，这些中枢神经系统细胞衍生的外泌体在促进血管生成、调节炎症和中风后大脑重塑方面发挥着关键作用[6-7]。巢蛋白（Nestin）是神经干细胞的特征性标志物，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）是星形胶质细胞活化的标志物，卒中后神经细胞的再生多伴随有Nestin 和GFAP 的表达升高[8-9]。因此，本研究拟观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响，进一步明确其起效机制，促进补气活血合剂的进一步推广应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取40 只成年雄性SPF 级SD 大鼠（广东省动物实验中心提供，合格证号：SCXKC(粤)2022-0002），体重200±20g。于广东省第二中医院动物实验中心分笼饲养，5 只/笼，温度25℃左右，相对湿度50%～60%，明暗周期12h，自由饮水、摄食，适应性饲养7天后将大鼠随机分为假手术组、模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869 组各10 只。按科技部2006 年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》处理实验动物，本研究经广东省第二中医院实验动物伦理委员会批准，批号：048604。

1.2 主要仪器与试剂

大鼠硅胶线栓（佳灵生物，广州）；动物用异氟烷（瑞普生物，天津）；氯化三苯基四唑（TTC）染色液（G3004，Solarbio）；戊二醛固定液（雷根生物，北京）；苏木素染液（上海生工生物工程，上海），伊红染液（索莱宝生物，北京）；Enhanced BCA Protein Assay Kit 测定试剂盒（P0009，Beyotime，China）；缓冲液（ES-8152，ECOTOP，China）；ECL Western Blotting Substrate（EX500B，ECOTOP，China）；Nestin、GFAP、CD63、GAPDH一抗（Abcam）。

1.3 模型制备

大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）大鼠模型复制采用Zea-Longa 改良法[10]：给予易氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1.5%）吸入麻醉，气体麻醉后，将大鼠仰卧固定，颈部脱毛、消毒，行颈部正中切口纵向切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及迷走神经。在颈总动脉近心端予医用缝合线结扎，予微动脉夹夹闭颈外动脉及颈总动脉远心端，在颈总动脉剪开一小切口，将线栓经该小切口沿颈总动脉缓慢向颈内动脉插入，出现轻度阻力时停止，此时线栓上黑点大约位于颈外动脉与颈内动脉分叉口上方1mm，线栓插入的深度约18.0±1.0mm，并在颈总动脉处结扎，以防线栓脱落。最后松开动脉夹，如无活动性出血后，逐层缝合皮肤。切口常规消毒，单笼饲养观察。2h 后，将线栓拔出1cm 左右，动物术后在25℃环境下饲养，自由进食、饮水。假手术组仅行血管神经分离操作，不作插线处理，其他操作相同。

1.4 干预方法

假手术组、模型组与补气活血合剂组同步灌胃等剂量生理盐水。补气活血合剂组、合剂+GW4869组在缺血再灌注2h后开始灌胃补气活血合剂（粤药制字Z20170002，广东省第二中医院制剂室提供），10mL/kg，3 次/日，连续灌胃7 天；其中合剂+GW4869 组前3 天每次灌胃前予腹腔注射外泌体抑制剂GW4869（2.5mg/kg·d），以抑制大鼠外泌体释放。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能评估

根据Zea-Longa 评分表[10]的5 分制行神经功能缺损评分。0 分：活动正常，无神经损伤症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪，提尾时，对侧前肢内收、屈曲（为轻度神经功能损伤）；2 分：行走时向对侧转圈（为中度神经功能损伤）；3 分：站立或行走时向对侧倾倒（为重度神经功能损伤）；4 分：不能自发行走，意识昏迷。评分值为1～3 分的MCAO 大鼠视为造模成功，纳入为研究对象。

1.5.2 TTC染色法测定大鼠脑梗死体积

干预7天后予易氟烷气体麻醉，断头取脑，放至培养皿中，迅速冷藏于-20℃冰箱，20min 后取出，将脑组织置于脑槽，沿冠状面间隔2mm 进行切片，切好的脑组织薄片浸泡在2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中，锡箔纸包好后避光置放于37℃恒温箱中30min，期间不断上下翻动脑组织薄片以使脑组织均匀浸泡染色液；30min 后进行拍照，采用Image J 软件对脑组织梗死体积进行测量。计算公式为：脑梗死体积百分比=梗死区体积/大脑体积×100%。

1.5.3 HE染色检测神经损伤程度

异氟烷吸入麻醉后，断头取脑，取缺血侧大脑运动皮层，组织取材后在PBS 中漂洗，4%PFA 中固定过夜。依次使用50%、70%、90%、100%乙醇脱水，进行石蜡包埋、切片，然后将切片进行二甲苯脱蜡，再次梯度乙醇（体积分数分别为100%、90%、70%、50%、70%）脱水，苏木精-伊红染色，100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。使用MshOt（ML31，China）拍照存图，于显微镜下取10 倍光镜观察脑组织冠状面切片，以每个样本左下象限视野为观察区域，观察治疗前后脑组织形态学改变。

1.5.4 Western blot 检测缺血皮质区Nestin、GFAP 蛋白表达

取冻存于-80℃冰箱的脑组织，称质量，加入适量RIPA 裂解液，冰上裂解15min 后，匀浆以13000×g离心20min。提取细胞总蛋白并测定蛋白含量，加入适量Loadingbuffer，用沸水将蛋白煮沸5min 进行蛋白变性，按每孔50μg 蛋白上样。电泳时采用80V电压将蛋白电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，然后换为120V 继续电泳70min，当溴酚蓝的条带跑至距胶底1cm 左右时停止电泳，开始电转，电转采用300mA 转膜70min。转膜完毕后，将蛋白所在区域切下，用含1%脱脂奶粉的TBST 封闭1h，后用Nestin、GFAP 一抗（均为1:1000）4℃孵育过夜，次日PBS 洗膜后采用辣根过氧化物酶标记的二抗37°C孵育45min，ECL 显色，GAPDH 为内参对照。Alpha Innotech®Fluor Chem FC2凝胶成像系统采集图像，Image J 软件定量分析Nestin、GFAP 的吸光度值，取Nestin、GFAP与GAPDH吸光度比值进行统计分析。

1.5.5 血清外泌体的提取及Western blot 检测CD63蛋白表达取血后RT 放置2h，4°C，1500rpm离心3min，取上清到新的EP 管，以2000g 离心力、4℃条件离心10min，移液枪将上清转移到新的离心管，以10000g离心力、4℃条件离心30min。取上清用0.22μm 针头滤器进行过滤，然后用0.22μm针头滤器的PBS进行配平，要求精确到小数点后3 位。使用超速离心机进行110000g、4℃、70min 的离心，用移液枪吸走上清，沉淀为初步分离的外泌体。用0.22μm 针孔滤器过滤的PBS 再次重悬外泌体并配平，再次进行120000g、4℃、70min 的离心。用移液枪吸走上清，倒置离心管在吸水纸上，使液体流干，加入50μL 的PBS 溶解外泌体，放置于-80℃长期保存。Western blot检测步骤同1.5.4。

1.6 统计方法

计量资料以均值加减标准差（±s）表示，多组间对照均值比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验，均由SPSS 19.0进行数据处理。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

干预后，假手术组未表现出神经功能缺损症状，模型组神经功能缺损评分显著升高（P＜0.01），补气活血合剂组神经功能缺损评分较模型组显著降低（P＜0.05）；应用GW4869后，神经功能缺损评分较补气活血合剂组显著升高（P＜0.01），模型组和合剂+GW4869组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 各组大鼠干预前后神经功能缺损评分比较

2.2 脑梗死体积

假手术组大鼠脑组织成正常红色，未见肉眼苍白梗死灶，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组均可见右侧大脑苍白梗死灶；与假手术组相比，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869 组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，补气活血合剂组的大鼠脑梗死体积比显著降低（P＜0.05）；与补气活血合剂组相比，合剂+GW4869 组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P＜0.01），模型组和合剂+GW4869组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、图3。

图2 各组大鼠梗死区TTC染色情况

图3 各组大鼠脑梗死体积百分比的比较

2.3 神经损伤程度

假手术组染色均匀，组织完整，神经细胞形状为圆锥状，排列整齐，核大居中，有明显的核仁。模型组脑皮层神经细胞排列不规则，神经元明显肿胀，核仁不明显，出现核固缩、细胞间隙存在不同大小的空泡样改变，出现间质水肿。与模型组比较，补气活血合剂组、合剂+GW4869 组神经元坏死减少、组织水肿的形态表现较轻。与合剂+GW4869组比较，补气活血合剂组坏死神经元和脑组织水肿等病理损伤较轻，见图4。

图4 各组大鼠大脑皮层的HE染色结果（10x/20x）

2.4 蛋白表达

Western-blot 结果显示：与假手术组相比，模型组GFAP、CD63 表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，补气活血合剂组GFAP、CD63 表达显著升高（P＜0.05）；加用GW4869 后，补气活血合剂组GFAP、CD63 表达显著下降（P＜0.05），Nestin 表达仅有与GFAP、CD63 相似的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图5、图6。

图5 各组大鼠梗死皮层中Nestin、GFAP及血清外泌体中CD63的表达

图6 各组大鼠梗死皮层中Nestin、GFAP及血清外泌体中CD63的表达的比较

3 讨论

脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中是主要类型，约占全球范围脑卒中患者总数的60%～70%[11-12]。溶栓是治疗急性卒中的有效方法，但遗憾的是其治疗时间窗仅为4.5h，超过该时间再使用溶栓药可能会得不偿失[13]，而出血转化和氧化应激是主要的临床风险，会进一步扩大病理级联反应[14]。而卒中后缺血半暗带的拯救是防止梗死区继续扩大、促进卒中恢复的有效目标[15]。因此，卒中后的神经保护对脑卒中患者的功能恢复非常重要。目前所有可用的神经保护药物在脑卒中治疗的临床研究中均以失败告终[16-17]，故进一步探索治疗脑卒中的有效候选药物也迫在眉睫。

越来越多的研究表明，中药及其有效成分在治疗心肌缺血、心力衰竭、缺血性中风、动脉硬化等各种心脑血管疾病（CCVDs）方面具有独特的疗效[18-19]。补气活血合剂是我院院内制剂，由我院刘悦教授从1992 年应用至今，以益气活血、化痰开窍为治法，由黄芪、赤芍、当归、何首乌、桃仁、瓜蒌子、半夏、陈皮、莱菔子、石菖蒲等药物组成，前期临床和基础实验[4-5,20]已对其疗效及有效成分等进行了初步验证。

本实验对补气活血合剂的临床起效机制进行了进一步探索，发现补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP、Nestin蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可能与促进外泌体分泌有关。巢蛋白（Nestin）是一种中间丝类型的蛋白，是能够特异性地表达在神经上皮干细胞上的一种分子标记物，为神经干细胞的特征性标志物；GFAP 是星形胶质细胞活化的标志物，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度；GFAP、Nestin蛋白表达的升高表明补气活血合剂可显著促进神经干细胞和星形胶质细胞的再生活化。外泌体直径约为30～150nm，是一种异质性细胞外囊泡，具有功能分子装饰的磷脂双分子层，富含蛋白质、脂类和核酸[21-22]。CD63 是外泌体的标志蛋白之一，其表达量可一定程度上代表外泌体的含量。作为全细胞植入的替代治疗策略，外泌体通过体液和循环将各种蛋白质和核酸传递给邻近和远处的受体细胞，在细胞间通信中发挥着关键作用[23]。最近，基于外泌体的治疗在脑卒中的血管生成、抗炎、神经发生和抗凋亡方面显示出巨大的作用[24-25]。小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经干细胞等多种中枢神经系统细胞均能分泌外泌体，并调节神经系统疾病的发生和发展。这些中枢神经系统细胞衍生的外泌体在促进血管生成、调节炎症和中风后大脑重塑方面发挥着关键作用[25]。因此推测，补气活血合剂可能是通过促进外泌体的分泌进一步调控了血管生成、炎症反应等而起到了对脑功能调控的作用。

然而，本实验仍然存在一定缺陷：首先，补气活血合剂是多种药物的复方制剂，其调控外泌体分泌的作用到底有哪些药物密切相关仍需要进一步研究；其次，补气活血合剂诱导的外泌体由何种细胞产生，以及外泌体中的何种成分起到关键作用，仍不清楚。

综上所述，本实验发现补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可能与促进外泌体分泌有关，但该制剂中的具体起效成分及其介导外泌体分泌的具体起效机制仍需进一步研究。