不同产地宽筋藤药材质量研究*

许广宁，曹斯琼，何嘉莹，邱韵静，胡绮萍，潘礼业，孙冬梅△

（1.广东省药品监督管理局审评认证中心，广东 广州 510000；2.广东一方制药有限公司·广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

宽筋藤又名伸筋藤、宽根藤等，为防己科植物中华青牛胆Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤茎，主产于广东、广西、云南、湖南等地，野生于村边、山坡、沟边疏林或灌木丛中[1]；其味苦性微寒，功效舒筋活络、祛风止痛，临床常用于风湿痹痛、筋脉拘挛、屈伸不利、跌打损伤[2]。宽筋藤作为骨科临床常用药材[3-4]，在民间以跌打风湿药应用历史悠久，主要含有黄酮类、木脂素类、苯丙素类、萜类、生物碱类等化学成分[5-8]，现代药理研究表明其具有镇痛、抗类风湿性关节炎等药理活性[9-11]。历版《中国药典》均未收载宽筋藤，作为地方用药，目前有关宽筋藤的质量评价研究较少[12]，与其产地相关的研究更少。由于宽筋藤的产地分布较广，在南方地区一带均有分布，因此对不同产地的宽筋藤药材进行研究，为其商品药材品质提供参考，具有十分重要的意义。本研究通过建立宽筋藤的超高效液相色谱（UPLC）特征图谱，并同法进行含量测定，对不同产地的宽筋藤药材质量进行综合评价，以期为宽筋藤药材及其制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

Thermo 高效液相色谱仪（vanquish，赛默飞公司），万分之一天平（AP224W，梅特勒-托利多公司），百万分之一天平（XBR36，梅特勒-托利多公司），恒温水浴锅（HWS28 型，上海一恒科技有限公司），超纯水系统（Comfort 1，德国赛多利斯公司）。

紫丁香苷对照品（含量：95.20%，批号：111574-201605），中国食品药品检定研究院；木兰花碱对照品（含量：98%，批号：wkq-20031310），四川省维克奇生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

21 批宽筋藤药材信息详见表1，经孙冬梅主任药师鉴定，为防己科植物中华青牛胆Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤茎。

表1 宽筋藤药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选择Waters HSS T3 C18（2.1×150mm，1.8μm）为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～9min，8%A；9～19min，8%→10%A；19～25min，10%→17%A；25～28min，17%→40%A；28～30min，40%→95%A）；检测波长为264nm，进样量为1μL，流速为0.35mL/min，柱温为30℃。

2.2 供试品溶液制备精密称定本品粉末（过三号筛）1g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备精密称取紫丁香苷对照品、木兰花碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

2.4 特征图谱研究

2.4.1 特征图谱方法学验证

2.4.1.1 精密度考察取同一份供试品溶液（S14），按“2.1”项色谱条件连续进样6 次，以15 号峰木兰花碱为参照峰，分别计算20 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.1.2 重复性考察 取同一批次药材（S14），采用“2.1”项下方法制备供试品溶液，平行制备6 份，按“2.2”项色谱条件分别进样，以15号峰木兰花碱为参照峰，分别计算20 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.1.3 稳定性考察取同一份供试品溶液（S14），采用“2.1”项色谱条件，分别室温放置0、2、4、6、8、12h进行测定，以15 号峰木兰花碱为参照峰，分别计算20 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品在室温放置12h稳定。

2.4.2 特征图谱建立及共有峰指认取21 批宽筋藤样品，按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，峰面积结果见表2。将所得色谱数据导入中药色谱特征图谱相似度评价系统（国家药典委员会，2012.0 版）进行结果分析，确定20 个共有峰，并生成了对照特征图谱R，计算各批次样品与对照特征图谱的相似度，结果均大于0.9，说明样品间质量较为接近，结果见图1、表3。通过与混合对照品指认，确定2个色谱峰的成分，分别为紫丁香苷（峰5）、木兰花碱（峰15），其中15号峰（木兰花碱）分离度较好，响应较高，位置居中，故以15号峰为参照峰S，见图2。

图1 21批宽筋藤药材UPLC特征图谱共有峰

图2 特征图谱共有峰指认

表2 21批宽筋藤药材UPLC特征图谱共有峰相对峰面积

表3 21批宽筋藤药材UPLC特征图谱相似度结果表

2.4.3 宽筋藤样品聚类分析将各色谱峰面积相对于称样量量化，运用SPSS 20.0软件对4个产地宽筋藤样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式。聚类分析将宽筋藤样品分为2 类，I类包括S1～S10，即广东肇庆和广东阳江聚为一类；Ⅱ类包括S11～S21，即广西河池与广西百色聚为一类，详见图3。

图3 聚类分析结果

2.4.4 偏最小二乘法分析以21 批不同产地的宽筋藤样品中20 个色谱峰相对峰面积作为变量，通过SIMCA 14.1 软件进行判别分析，共得到2 个主成分，其模型解释率参数R2X为0.679，R2Y为0.804，Q2为0.626，模型的预测能力较好（见图4），并通过20折置换检验，得到R2拟合Y 坐标的截距为0.261，小于0.3，说明模型拟合较好；Q2 拟合Y 坐标的截距为-0.195，小于0.05，说明模型未过度拟合，见图5。21批样品的得分图见图6，广东肇庆、广东阳江分为一类，广西百色、广西河池分为一类，与聚类分析的结果一致。对主要影响的变量VIP 值进行分析（见图7），以VIP 值大于1 限度，得到7 个贡献度高的差异性化合物，分别为峰12、峰18、峰11、峰7、峰2、峰17、峰20，说明上述几个成分可能为宽筋藤的潜在质量标志物。

图4 2个主成分累计贡献率

图5 置换验证图

图6 不同样品PLS-DA得分图

图7 PLS-DA VIP值图

2.5 含量测定研究

2.5.1 线性考察精密称取木兰花碱对照品2.270mg于10mL量瓶中，加甲醇制成223.0956µg/mL的对照品母液。精密量取上述木兰花碱对照品母液0.1mL，置50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL 含木兰花碱对照品0.446µg 的对照品溶液；精密量取上述母液0.10.4mL、0.4mL，分别置5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL 含木兰花碱对照品4.462µg、17.848µg 的对照品溶液；精密量取上述对照品母液0.2mL、0.3mL、0.7mL、1mL，分别置2mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL 含木兰花碱对照品22.310µg、33.464µg、78.083µg、111.548µg 的对照品溶液；分别按照“2.1”项下色谱条件依次进样1μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，线性回归方程为：y=5292.6x+4400.4，相关系数r=0.9996，表明在浓度为0.446μg/mL～111.548μg/mL的范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度考察精密吸取木兰花碱对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，以木兰花碱峰面积计算RSD为0.98%，说明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性考察取本品粉末（S19），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12h 进样测定，计算峰面积RSD 值为2.10%，说明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.5.4 重复性考察取同一批药材粉末（S19）约1g，精密称定，平行称定6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量RSD值为1.46%，该分析方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收率考察取本品粉末（S19）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行制备6 份，每份按照对照品与样品含量比例为1：1 加入对照品，按“2.2”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定，计算加样回收率范围为94.92%～102.89%，RSD值为2.99%，结果表明回收率良好。

2.5.6 样品测定取21 批宽筋藤样品按上述方法进行含量测定，结果见表4。根据结果可知木兰花碱含量均值为0.64mg/g，RSD 为30.60%，实测范围0.35～1.31mg/g，广东肇庆的含量均值为0.76mg/g，广东阳江的含量均值为0.66mg/g，广西河池的含量均值为0.52mg/g，广西百色的含量均值为0.63mg/g，说明不同产地间的含量波动较大。

表4 21批宽筋藤样品含量测定结果

3 讨论

本文采用超高效液相色谱法（UPLC）建立了同法测定宽筋藤特征图谱及含量测定的方法，对21批来自广东肇庆、广东阳江、广西河池、广西百色的宽筋藤进行系统研究。宽筋藤化学成分丰富，利用超高效液相色谱法（UPLC）分析时间短、效率高的优势，可以实现快速分析。同时对不同检测波长进行了考察，最终选择了色谱峰信息最丰富的264nm 为检测波长，并在此基础上对流动相进行考察，选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相系统，所建立的方法科学合理。

特征图谱研究结果显示，不同产地间的样品质量较为接近，相似度达到0.9 以上。聚类分析及偏最小二乘法分析结果显示，广东肇庆、广东阳江的样品可以分为一类，广西百色、广西河池的样品可以分为一类，两者结果一致。偏最小二乘法分析结果同时提取了7 个成分，可能为宽筋藤的潜在质量标志物，但本研究尚未能明确其具体成分，有所不足，下一步可继续研究。文献研究显示，生物碱是宽筋藤的药理药效成分之一，因此本研究对特征图谱中确认的生物碱成分木兰花碱进行了定量研究。含量测定结果显示，不同产地的宽筋藤药材木兰花碱的含量波动较大，因此可以选择木兰花碱作为宽筋藤的质量控制指标，从而客观反映宽筋藤药材的质量差异[8]。有文献报道宽筋藤药材在全国分布无明显地域特征，但在一些相邻的省份药材质量较为相似[13]。本研究选定的4 个产地均为岭南地区，为亚热带季风气候，光热充沛，雨热同季，夏长冬短，因此受环境影响，宽筋藤药材的质量从特征图谱可见整体相对稳定。但广东肇庆、广东阳江为北回归线附近地区，沿海气候，而广西河池、广西百色地处云贵高原南麓，是典型的山区环境，因此地区环境差异导致不同产地宽筋藤药材质量的略有不同。

本研究通过建立宽筋藤药材的UPLC特征图谱及含量测定方法，对4 个不同产地的21 批宽筋藤药材进行了综合评价，结果能更全面反映不同产地宽筋藤药材的质量，为宽筋藤药材的质量控制提供了参考。