双酚A及其3种替代物对肝细胞甘油三酯合成的影响

陈阳，高文婷，李肖，姬晓彤，白剑英，2

（1.山西医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室，太原 030001；2.煤炭环境致病与防治教育部重点实验室，太原 030001）

双酚A［2，2-bis（4-hydroxyphenyl）propane，BPA］是一种典型的环境内分泌干扰物，广泛用于生产聚碳酸酯和环氧树脂等［1-2］。研究［3-7］表明，BPA可增加女性不孕和复发流产率，与肥胖、2型糖尿病、肝功能异常的发生有关，还可增加患癌症的风险。BPA可通过调节脂肪酸从头合成相关基因的表达，影响脂质合成［8］，此外，成年小鼠长期接触BPA会增加其肝脏的脂质含量［9］。越来越多的研究［10-11］表明BPA具有毒性作用，因此，BPA的使用已受到限制。近年来，某些结构上类似于BPA的新型化学物，如双酚AF［4，4’-（hexafluoroisopropylidene）diphenol，BPAF］、双酚B［2-bis（4-hydroxyphenyl）butane，BPB］、双酚S（4-hydroxyphenyl sulfone，BPS）和双酚F（4，4’-methylenediphenol，BPF）作为BPA的替代品被广泛使用。研究［12-14］显示，在水、沉积物等环境介质中均检测到BPA及类似物。在中国南京高淳区学龄前儿童尿样中，典型双酚类似物BPA、BPAF、BPF和BPS的总质量浓度为2～3 113 ng·L-1，与我国深圳和广州3～11岁儿童的检测结果一致［15］。

由于BPA及其类似物存在化学结构的相似性，BPA类似物是否安全也受到了广泛关注。我国的一项流行病学研究［16］发现，暴露于BPS可增加非酒精性脂肪肝（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）的发病率。LIU等［17］研究发现，部分BPA类似物可导致细胞内甘油三酯（triglyceride，TG）合成增多。因此，BPA类似物对肝细胞脂代谢的作用值得深入研究。本研究拟观察BPA、BPAF、BPB和BPS染毒HL-7702细胞后，细胞内脂质蓄积情况、TG含量及TG合成相关基因的mRNA表达水平，以探讨BPA、BPAF、BPB和BPS是否引起肝细胞脂质蓄积，为制定BPA及其类似物的环境卫生标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人正常肝细胞株HL-7702，由陕西中医药大学秦绪军教授惠赠。

1.1.2 主要仪器：Galaxy 170S CO2培养箱（德国Eppendorf公司），Model 680型酶标仪（美国Bio-rad公司），UV-2450型紫外分光光度仪（上海纳诺仪器有限公司），line gene 9600型荧光定量PCR仪（杭州BIOER科技有限公司），HFsafe-1200型生物安全柜［力新仪器（上海）有限公司］，高速低温离心机 Neofuge 15R［力新仪器（上海）有限公司］，倒置荧光显微镜 BX51（日本 Olympus 公司）。

1.1.3 主要试剂：BPA、BPAF、BPB、BPS（上海梯希爱化成工业发展有限公司），DMEM高糖培养基（上海金畔生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亚砜、胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），BCA 试剂盒（武汉博士德生物有限公司），油红O粉末（美国Sigma公司），TG试剂盒（南京建成生物工程研究所），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（上海翌圣生物科技有限公司），反转录试剂盒Primer Script RT MASTER Mix、RNA提取试剂RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将人正常肝细胞HL-7702接种于DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 实验分组及染毒：选取对数生长期细胞，接种于细胞培养板并培养。待细胞密度约达80%时，将细胞随机分为6组，分别为空白对照组，溶剂对照（0.1% DMSO）组，油酸（1 mmol/L OA）组，1、10、50 μmol/L BPA、BPAF、BPB和 BPS组。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后进行后续相关实验。

1.2.3 油红O染色：选取对数生长期细胞接种于6孔板中，按上述分组进行染毒，染毒时每组设置3个平行孔，染毒24 h后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，加入60%异丙醇浸洗5 min，加入油红O工作液浸染20 min（常温避光），加入苏木素复染核1 min，倒置显微镜下观察细胞内出现脂滴的情况，并采集图像。

1.2.4 GPO-PAP酶法测定细胞内TG含量：细胞染毒24 h，用PBS漂洗2次，胰酶消化后，加入1 mL PBS缓冲液制成细胞悬液，其中250 μL于1 000 r/min离心10 min后弃上清，用BCA法测定蛋白浓度，其余750 μL用于测定TG含量。按照文献［18］的方法，用异丙醇、己烷、乙醚等有机溶剂抽提细胞内脂质。按试剂盒说明书操作步骤进行测定。

1.2.5 实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定肝细胞内TG合成相关基因mRNA的表达

染毒结束后，用PBS清洗细胞2次，加入适量的RNAiso裂解细胞，提取RNA。用超微量紫外分光光度仪检测总 RNA 浓度和纯度，纯度范围为 1.8～2.2。采用20 μL体系反转录，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，获得逆转录产物cDNA。以2 μL cDNA为模板，β-actin为内参，使用Line Gene 9600荧光定量PCR仪检测TG合成相关基因的mRNA表达水平。PCR引物序列见表1。

表1 相关基因引物序列Tab.1 Related gene primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 油红O染色结果

如图1所示，空白对照组与溶剂对照组细胞内未见红色脂滴，1 mmol/L OA组细胞内可见有大量红色脂滴，且红色脂滴围绕细胞膜内侧边缘呈环状分布，说明HL-7702脂肪变性模型建立成功，可作为阳性对照。与空白对照组和溶剂对照组相比，1、10、50 μmol/L BPA组、BPAF组、BPB组和BPS组细胞内均可观察到大小不等的红色脂滴。

2.2 细胞内TG含量

如图2所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，1 mmol/L OA组细胞内TG含量明显增加（P＜0.05）；1、50 μmol/L BPA组，10、50 μmol/L BPAF组，1、10、50 μmol/L BPB组和50 μmol/L BPS组细胞内TG含量明显增加（P＜0.05）。

图2 BPA及其类似物染毒后肝细胞内TG含量（n=3）Fig.2 Triglyceride content in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

2.3 TG合成相关基因mRNA的表达

如图3所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，10 μmol/L BPAF组，1、10 μmol/L BPS组细胞LIPIN2mRNA表达水平升高（P＜0.05），与空白对照组相比，10 μmol/L BPB组细胞内LIPIN2mRNA表达水平升高（P＜0.05）。与溶剂对照组相比，50 μmol/L BPAF组、50 μmol/L BPB组细胞内LIPIN2mRNA表达水平升高（P＜0.05）。

图3 BPA及其类似物染毒后肝细胞内LIPIN2 mRNA表达水平的变化（n=3）Fig.3 Changes in LIPIN2 mRNA expression levels in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

如图4所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，50 μmol/L BPA组、10 μmol/L BPAF组、50 μmol/L BPB组和1 μmol/L BPS组细胞内DGAT2mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与空白对照相比，1 mmol/L OA组细胞内DGAT2mRNA表达水平升高（P＜0.05），10 μmol/L BPB组细胞内DGAT2mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与溶剂对照组相比，10 μmol/L BPA组细胞内DGAT2mRNA表达水平降低（P＜0.05）。

图4 BPA及其类似物染毒后肝细胞内DGAT2 mRNA表达水平的变化（n=3）Fig.4 Changes in the expression level of DGAT2 mRNA in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

3 讨论

BPA及其类似物不仅对神经系统、生殖系统、内分泌系统及免疫系统具有毒性作用，而且对肝脏脂代谢也有一定的影响。但目前关于BPA及其类似物对肝脏脂代谢的研究还较少见。

本研究中，油红O染色结果发现，与空白对照组相比，1 mmol/L OA 组细胞内有明显的脂肪蓄积，脂滴数量较多，且大小不等，围绕细胞膜内侧边缘呈环状分布，说明油酸用于建立HL-7702细胞脂肪变性模型成功。BPA、BPAF、BPB和BPS染毒不同剂量组细胞内均可观察到大小不等的红色脂滴，说明不仅是BPA，BPA类似物也可导致肝细胞内脂肪蓄积。TG含量测定发现，与空白和溶剂对照组相比，1、50 μmol/L BPA组，10、50 μmol/L BPAF组，1、10、50 μmol/L BPB组和50 μmol/L BPS组细胞内TG含量明显增加，其余各剂量组细胞内TG含量也有增加的趋势。因此，形态学观察和定量分析都表明BPA及其类似物BPAF、BPB和BPS均可导致肝细胞内脂肪蓄积，TG含量增加。

LIPIN家族蛋白具有磷脂酸磷酸酶活性，在脂质合成中起关键作用。细胞内脂肪酸水平升高时，存在于细胞质中的LIPIN蛋白转移至内质网（endoplasmic reticulum，ER），与磷脂酸（phosphatidic acid，PA）结合，并催化PA去磷酸化，促进甘油二酯（diacylglycerol，DAG）合成［19］。卞京等［20］研究发现，宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）大鼠肝脏中LIPIN2mRNA及蛋白表达上调，可引起肝脏脂肪含量增加。孕期营养限制导致后代脂肪组织增多，脂肪细胞中LIPIN1和LIPIN2的过度表达导致TG积累增加［21］。贺真等［22］用MEHP处理人肝癌HepG2细胞，发现LIPIN2基因的高表达使细胞内TG含量明显增加，其高表达为细胞内TG合成的最后一步提供了更多的底物。二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是催化TG合成最后一步反应的关键酶。DGAT2过表达使野生小鼠肝脏内TG含量增加［23］。ZHANG等［24］研究发现，DGAT2过表达可刺激牛骨骼肌卫星细胞中脂滴形成和TG积累。研究［20］发现，DGAT2mRNA表达水平升高可促进HepG2细胞内TG合成增加。本研究中，BPA及其类似物染毒细胞24 h后，与空白对照组比较，10 μmol/L BPAF组，10 μmol/L BPB组，1、10 μmol/L BPS组细胞内LIPIN2mRNA表达水平明显升高，50 μmol/L BPA组，10 μmol/L BPAF组，10、50 μmol/L BPB组和1 μmol/L BPS组细胞内DGAT2mRNA表达水平均明显升高。BPAF、BPB和BPS均可通过上调LIPIN2和DGAT2mRNA表达促进TG合成增加。BPA仅上调DGAT2mRNA表达，说明BPA类似物影响肝细胞TG合成的途径可能更广泛，需要进一步研究。

综上所述，本研究发现BPA可能通过上调DGAT2mRNA的表达促进TG合成的增加，导致人正常肝细胞内脂肪蓄积。不仅如此，BPAF、BPB及BPS还可能通过上调LIPIN2mRNA的表达提供更多的DAG，进一步导致TG合成的增加，因此，BPA替代物的安全性值得进一步探讨。