基于复合纳米材料比色/荧光双信号的黄曲霉毒素B1检测

李 阳，鲁 迨，周 州，陈丽叶，谢新辉，吴家浩，赵 倩,，石星波

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410007）

黄曲霉毒素是主要由黄曲霉和寄生霉产生的有毒次生代谢物，结构为二呋喃环和香豆素环组成的二呋喃酮萘酮的衍生物[1]。黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最大、致癌性最强，已被世界卫生组织列为I类致癌物[2-3]。为了保障食品安全，开发准确检测食品中AFB1含量的方法尤其重要，常用的检测方法主要有薄层色谱法[4]、高效液相色谱（high performance liquid chromatograpy，HPLC）法[5]、免疫化学检测法[6]等。色谱法灵敏度高、稳定性好，但仪器设备昂贵和需要专业技术人员。免疫化学检测法中酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）应用最为广泛，但ELISA依赖昂贵的抗体[7]和酶，而天然酶具有制备成本高、耐酸碱性低、稳定性差、储存不便的缺陷[8]，同时单一信号输出容易出现假阳性。因此，构建新型ELISA传感策略以实现对AFB1的高灵敏便携检测至关重要。

纳米材料的引入为开发新型的ELISA带来了机遇，如可作为载体负载识别分子或者酶用于信号放大、作为纳米酶偶联抗体用于信号调节以及作为底物用于信号输出[9]。石墨烯量子点（graphene quantum dots，GQDs）是一种零维碳纳米材料，制备简单且具有很强的荧光特性[10-11]，可以作为底物实现荧光信号输出，同时提高ELISA检测的灵敏度。二氧化锰纳米颗粒（MnO2nanoparticles，MnO2NPs）比表面积大、具有较宽的光吸收性能[12]，可以作为能量受体有效地猝灭荧光物质的荧光，此外其还具有优异的模拟酶性能[13]，可以催化酶底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）显色[14]，实现比色信号输出。若将两种材料组合，则可实现比色/荧光信号同时输出，为构建双模信号ELISA提供选择[15]。

核酸适配体（aptamer，Apt）作为一种新型识别元件，亲和力和特异性高、免疫原性低，已广泛应用于食品安全检测中[16-17]。真菌毒素等小分子分子质量小、抗原表位单一，不能同时结合两个抗体，一般使用竞争ELISA对其进行检测[18]，特异性不够好。将抗体与Apt组合对目标物的识别表现出了较好的特异性，可以实现小分子“三明治”夹心ELISA检测[19]。

本实验基于GQDs与MnO2NPs构建了一种比色/荧光双信号输出平台用于AFB1的高灵敏便携式检测。使用SiO2纳米颗粒（SiO2nanoparticles，SiO2NPs）为载体，将谷胱甘肽（glutathione，GSH）和AFB1-Apt富集在SiO2NPs上制备SiO2NPs@GSH@Apt识别探针。使用MnO2NPs偶联GQDs的复合纳米材料MnO2NPs@GQDs为底物，基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），MnO2NPs有效猝灭GQDs的荧光，同时MnO2NPs@GQDs能有效地催化TMB氧化为蓝色氧化态TMB。SiO2NPs@GSH@Apt识别探针与AFB1抗体共同识别目标物AFB1，形成夹心型结构。GSH具有很强的还原性，能将MnO2NPs还原成Mn2＋[20]，MnO2NPs@GQDs的类过氧化物酶能力减弱，而GQDs被猝灭的荧光不断恢复，通过底物荧光强度以及TMB颜色的变化对实现对AFB1的可视化及荧光检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬酸、氢氧化钠、30% H2O2、硫酸 国药集团化学试剂有限公司；高锰酸钾 衡阳市凯信化工试剂有限公司；聚丙烯胺盐酸盐（poly(allylamine hydrochloride)，PA H）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydro，EDC）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上海源叶生物科技有限公司；AFB1标准品 山东美正生物科技有限公司；二氧化硅纳米颗粒 天津均益佳科技有限责任公司；谷胱甘肽 合肥博美生物科技有限责任公司；TMB 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；AFB1-Apt序列（5′-3′）GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC[21]生工生物工程（上海）股份有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA124S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；SPARK 20M多功能酶标仪 瑞士帝肯公司；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度电位仪 马尔文帕纳科公司；Heraeus Pico 17离心机 美国赛默飞世尔科技公司；TCS-10金属恒温振荡器 杭州瑞诚仪器有限公司；JEM-2100F透射电子显微镜 日本电子光学公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 GQDs的制备

参考文献[22]采用直接热解法。称取2 g柠檬酸，200 ℃反应30 min，得到橙色液体时标志GQDs形成。将GQDs逐滴加入到100 mL（0.25 mol/L）的NaOH溶液中，随后调节溶液pH值至7.0得到GQDs溶液。将其放入干燥箱中60℃烘干至质量恒定后称量，得到所制备的GQDs质量浓度为19.8 mg/mL。

1.3.2 MnO2NPs的制备

参考文献[23]的方法用PAH将高锰酸钾还原成MnO2NPs。称取35 mg高锰酸钾溶于40 mL去离子水中，加入5 mL 40 mg/mL的PAH溶液，在超声的辅助下反应15 min，随后透析48 h（3 000 Da）得到纯化的MnO2NPs。将其放入干燥箱中60 ℃烘干至质量恒定后称量，得到所制备的GQDs质量浓度为3.7 mg/mL。

1.3.3 MnO2NPs@GQDs复合底物的合成及性质

取5 mL 198 μg/mL的GQDs溶液与5 mL质量浓度为7.4、18.5、37、74、185、370 μg/mL的MnO2NPs室温反应得到不同质量浓度的MnO2NPs@GQDs复合材料，将未加入与加入MnO2NPs的GQDs的荧光强度分别记为F0、F1，以F0与F1差值ΔF1为参考确定底物合成最佳的MnO2NPs质量浓度。接下来探究底物合成所需的时间，在GQDs溶液加入MnO2NPs后，每隔10 min测量其荧光强度，确定最佳反应时间。

考察MnO2NPs、GQDs、底物以及底物在引入GSH后的类过氧化物酶特性和荧光特性的变化，分别配制4 种溶液：1）MnO2NPs溶液：250 μL MnO2NPs＋750 μL H2O；2）GQDs溶液：250 μL GQDs＋750 μL H2O；3）MnO2NPs@GQDs 溶液：500 μL MnO2NPs@GQDs＋500 μL H2O；4）MnO2NPs@GQDs＋GSH溶液：500 μL MnO2NPs@GQDs＋500 μL GSH。将4 种溶液置于45 ℃反应40 min，待反应完成后各取200 μL液体测定荧光光谱，同时各取50 μL液体加入50 μL TMB和50 μL H2O2，室温反应45 min，加入50 μL 1 mol/L的H2SO4溶液终止反应，测定紫外-可见吸收光谱并记录在450 nm波长处的吸光度A450nm。

1.3.4 SiO2NPs@GSH@Apt探针的制备及优化

对探针上的GSH浓度进行优化，将1 mL表面氨基化的SiO2NPs溶液（0.1 mg/mL）与1 mL不同浓度（0、0.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15 mmol/L）的GSH溶液室温反应1 h，随后将1 mL 100 nmol/L用4 mmol的EDC和1 mmol的NHS活化后的Apt加入其中室温反应1 h。接着8 000 r/min离心3 min，重复3 次得到纯化的探针。400 μL不同GSH浓度的探针与400 μL底物45 ℃反应40 min，测定同1.3.3节。将有、无GSH的探针加入到底物后的荧光值分别记为F2、F3，以F2与F3荧光差值ΔF2和A450为参考得到最佳GSH浓度。对SiO2NPs表面富集GSH的温度与时间进行优化，考察SiO2NPs在不同温度下（15、25、35、45、55、65 ℃）以及不同反应时间下（10、20、30、40、50、60、70、80 min）对GSH富集情况，以ΔF2和A450nm为参考得到最优反应温度与反应时间。

1.3.5 基于SiO2NPs@GSH@Apt探针和MnO2NPs@GQDs底物对AFB1的检测

基于探针和底物构建了基于夹心法ELISA用于AFB1的检测，具体操作步骤如下：1）AFB1抗体包被：将100 μL 0.01 mg/mL AFB1抗体加入96微孔板中，4 ℃孵育12 h。2）封闭：取出微孔板，弃去液体，PBS洗涤3 次后加入100 μL 0.01 mg/mL BSA，37 ℃孵育1 h。3）连接抗原：取出微孔板，弃去液体，PBS洗涤3 次后加入100 μL不同质量浓度AFB1，37 ℃孵育1 h。4）弃去液体，PBS洗涤3 次后加入100 μL探针，25 ℃反应1 h。5）弃去液体，PBS洗涤3 次后加入100 μL底物，45 ℃反应40 min。测定同1.3.3节。

1.3.6 可行性分析

将100 μL同浓度的SiO2NPs、SiO2NPs@GSH、SiO2NPs@Apt、SiO2NPs@GSH@Apt分别加入到铺好AFB1抗原的微孔板中，25 ℃反应1 h，弃去液体，PBS洗涤3 次后加入100 μL底物，45 ℃反应40 min。测定同1.3.3节。

1.3.7 反应条件优化

将200 μL探针加入到200 μL底物中，考察其在不同温度下（15、25、35、45、55、65 ℃）以及不同反应时间下（10、20、30、40、50、60 min）的荧光强度和类过氧化物酶特性变化，确定最优反应温度与反应时间。

1.3.8 特异性分析

为验证本方法检测AFB1的特异性，选择黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）、T-2毒素（trichothecenes，T-2）、棒曲霉毒素（Patulin）、伏马毒素（fumonisin B1，FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）以及混合毒素进行特异性验证，其中单一毒素质量浓度为10-8g/mL，混合毒素中的干扰毒素质量浓度为10-8g/mL、AFB1质量浓度为10-9g/mL。操作同1.3.5节，将AFB1分别用上述毒素代替。

1.3.9 实际样品中AFB1的检测

使用商业化的ELISA试剂盒和HPLC检测牛奶、大米、麦片、酱油、白醋5 种实际样品中的AFB1含量，验证本方法的准确性。检测前需对所选的样品进行预处理，步骤如下：1）牛奶：取1 mL样品加入3 mL去离子水混合均匀。2）大米、麦片、酱油：将样品粉碎后取5 g样本加入60%甲醇溶液25 mL，振荡10 min；取液体于4 000 r/min离心5 min；取上清液1 mL加入4 mL去离子水混合均匀。3）白醋：取1 mL样品加入60%甲醇溶液5 mL，振荡均匀；取液体1 mL加入4 mL去离子水混合均匀。操作同1.3.5 节，将AFB1分别用上述预处理过的实际样品代替。

选择牛奶样品作为加标样品进行加标回收的检测。分别取1 mL待测液加入AFB1标准品溶液，使AFB1的终质量浓度分别为1×10-9、1×10-10、1×10-11g/mL，计算得到加标回收率。

1.4 数据处理

所有实验均重复3 次，从酶标仪和荧光分光光度计中导出数据，利用Excel进行数据处理，使用Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 检测原理

检测原理如图1所示，使用SiO2NPs作为载体富集GSH和AFB1-Apt构建SiO2NPs@GSH@Apt识别探针，MnO2NPs偶联GQDs的复合纳米材料MnO2NPs@GQDs为底物。在聚苯乙烯微孔板上包被AFB1抗体，当有目标物AFB1存在时，探针上的AFB1-Apt和抗体共同识别并捕获AFB1，形成夹心结构，以GSH控制底物荧光及比色信号的输出。底物具有MnO2NPs类过氧化物酶的特性，能够有效地催化酶底物TMB显色，且MnO2NPs具有较宽的光吸收性能，能有效猝灭GQDs的荧光。但由于探针上的GSH具有很强的还原性，能将MnO2NPs还原成Mn2＋，此时底物的类过氧化物酶特性消失，不能催化TMB氧化变色，但底物中GQDs被猝灭的荧光恢复。当目标物AFB1浓度越高，溶液的荧光信号逐渐增强，比色信号逐渐减弱，通过底物荧光强度以及TMB颜色的变化对AFB1进行定量及可视化检测。

图1 比色/荧光双模信号检测AFB1原理图Fig.1 Schematic illustration of the dual-mode signal for colorimetric and fluorescence detection of AFB1

2.2 GQDs、MnO2NPs和MnO2NPs@GQDs制备及表征

如图2A所示，GQDs的最大激发波长为370 nm，最大发射波长为465 nm，在紫外灯照射下发出了很强的蓝色荧光。对MnO2NPs紫外-可见吸收光谱进行测定，其在250～600 nm波长处有比较宽的吸收范围。由图2B可以看到，MnO2NPs为球状，且分散性较好。随机选取100 个MnO2NPs进行粒径分析，结果表明该尺寸分布在1.2～3.4 nm之间，平均粒径为2.2 nm。由图2C可以看出，GQDs也为球状结构。GQDs粒径分布在2.7～6.7 nm之间，平均粒径为3.75 nm。

图2 GQDs、MnO2NPs和MnO2NPs@GQDs的表征Fig.2 Characterization of GQDs,MnO2NPs and MnO2NPs@GQDs

为考察MnO2NPs@GQDs复合纳米材料是否成功合成，通过红外光谱图分析MnO2NPs、GQDs及MnO2NPs@GQDs表面功能基团，如图2D所示，1 600 cm-1是C＝O的不对称伸缩振动，3 500 cm-1为O—H的面内弯曲振动[22]，GQDs表现出了对羧基和羟基的吸收，表明其含有—COOH基团；MnO2NPs表现出了对羰基和羟基的吸收，且Mn—O的伸缩振动导致MnO2NPs在527 cm-1处出现小的特征峰；复合纳米材料在527 cm-1处也有小的特征峰[24]，对羰基和羟基也表现出吸收，说明MnO2NPs与GQDs偶联形成了MnO2NPs@GQDs复合纳米材料。通过X射线衍射仪对MnO2NPs@GQDs进行晶体结构分析，如图2E所示，2θ为28.7°、37.3°、56.7°时出现的特征峰与β-MnO2的110、101、211晶面匹配[25]，2θ＝24°附近出现的宽峰对应于石墨的002平面，来源于GQDs的石墨结构[26]。从3 种材料的电位表征图（图2F）可见，GQDs带负电，MnO2NPs带正电，由于静电吸附作用MnO2NPs与GQDs结合得到MnO2NPs@GQDs复合纳米材料，MnO2NPs@GQDs带正电，提示MnO2NPs@GQDs的成功合成。

对底物的类过氧化物酶特性和荧光特性进行探究。由图3A所示，MnO2NPs具有类过氧化物酶特性，能将TMB氧化成蓝色产物，在硫酸终止下变成黄色；而GQDs没有类酶活性，在GQDs中加入TMB与H2O2以及终止液后溶液呈无色状态；MnO2NPs@GQDs底物在加入TMB与H2O2以及终止液后溶液呈黄色，说明底物也具有类过氧化物酶特性；在加入GSH后，GSH将MnO2NPs还原成Mn2＋，底物的类酶活性消失，插图为MnO2NPs、GQDs、MnO2NPs@GQDs、MnO2NPs@GQDs＋GSH四种溶液加入TMB与H2O2以及终止液后的颜色图片。如图3B所示，MnO2NPs不发荧光；而GQDs具有很强的荧光特性，在465 nm处具有很高的荧光发射峰；MnO2NPs与GQDs复合形成MnO2NPs@GQDs底物后，基于FRET，GQDs的荧光被MnO2NPs猝灭导致底物荧光强度很低；加入GSH后，MnO2NPs还原成Mn2＋，MnO2NPs对GQDs荧光的猝灭效果减弱，底物荧光逐渐恢复。插图为MnO2NPs、GQDs、MnO2NPs@GQDs、MnO2NPs@GQDs＋GSH四种溶液在360 nm紫外灯下的图片，可以清楚看到4 种溶液的荧光强度变化。

图3 GSH加入前后MnO2NPs@GQDs的类过氧化物酶特性（A）及荧光特性（B）Fig.3 Peroxide-like properties (A) and fluorescence intensity (B) of MnO2NPs@GQDs before and after adding GSH

2.3 MnO2NPs@GQDs底物条件优化

如图4A所示，随着MnO2NPs质量浓度不断的增大，GQDs的荧光不断被猝灭，当质量浓度达到74 μg/mL时ΔF1最大，所以以此为最佳质量浓度。对MnO2NPs与GQDs的孵育时间进行优化，从图4B可以看出，ΔF1随着时间的延长而增加，在90 min后趋于稳定，因此选择最佳孵育时间为90 min。

图4 底物制备时MnO2NPs质量浓度（A）和反应时间（B）条件的优化Fig.4 Optimization of concentration of MnO2NPs (A) and reaction time (B) for substrate preparation

2.4 SiO2NPs@GSH@Apt探针制备及条件优化

SiO2NPs@GSH@Apt探针是通过氨基修饰的SiO2NPs首先与GSH羧氨结合、接着与羧基化的Apt静电吸附偶联而成。对探针进行Zeta电位表征，如图5A所示，氨基修饰的SiO2NPs带正电，加入GSH后由于缩合反应SiO2NPs@GSH正电位值增加，但加入羧基化Apt后，SiO2NPs@GSH@Apt正电位值减少，说明GSH、Apt已成功富集在SiO2NPs表面，证实了SiO2NPs@GSH@Apt探针的成功合成。

图5 SiO2NPs@GSH@Apt的表征及制备条件优化Fig.5 Characterization of SiO2NPs@GSH@Apt and optimization of its preparation conditions

对探针制备过程中GSH浓度及SiO2NPs富集GSH温度与时间进行优化。如图5B所示，随着探针上的GSH浓度不断增大，底物的荧光强度逐渐增强，对TMB的氧化效果逐渐减弱。当GSH终浓度为5 mmol/L时，底物的荧光强度恢复接近稳定，但底物与TMB反应得到的TMB氧化产物吸光度很低，为了实现比色及荧光的双模信号同时输出，选择终浓度为2.5 mmol/L的GSH进行后续实验。如图5C所示，在35 ℃条件下底物的荧光强度恢复最多且对TMB的氧化效果最弱，说明此温度下SiO2NPs表面富集的GSH最多，所以选择35 ℃作为最佳反应温度。如图5D所示，反应时间到60 min时底物的荧光强度恢复接近稳定且对TMB的氧化效果也趋于稳定，说明此时SiO2NPs表面的GSH富集达到饱和，因此SiO2NPs富集GSH的时间选择为60 min。

2.5 可行性验证及反应条件优化

将SiO2NPs、SiO2NPs@GSH、SiO2NPs@Apt、SiO2NPs@GSH@Apt分别加入到底物中，对底物的比色/荧光信号输出进行探究。从图6A、B可以看到，SiO2NPs两种信号与空白响应值相差不大，没有识别目标物和与底物反应的功能；SiO2NPs@GSH对两种信号都有轻微的响应，但其缺少对目标物的识别功能；SiO2NPs@Apt具备识别功能，但其没有信号响应；SiO2NPs@GSH@Apt具备识别功能且比色与荧光信号明显响应，这说明基于SiO2NPs@GSH@Apt探针与MnO2NPs@GQDs底物构建检测AFB1的方法可行。

图6 AFB1检测可行性研究及反应条件优化Fig.6 Feasibility of AFB1 detection and optimization of reaction conditions

对探针与底物的反应时间与温度进行优化。如图6C所示，随着反应时间延长，探针上的GSH与底物不断反应使MnO2NPs还原成Mn2＋，到40 min底物的荧光及类过氧化物酶活性趋于稳定，因此后续实验中探针与底物反应时间选择为40 min。由图6D可以看到，在45 ℃条件下底物的荧光和类过氧化物酶活性效果最好，所以选择此温度作为探针与底物最佳反应温度。

2.6 AFB1检测灵敏度及特异性分析

在最优条件下，向检测体系中加入AFB1标准溶液（10-12～10-6g/mL），以底物荧光差值∆F（∆F=F4-F5，F4、F5分别为加入毒素和超纯水后底物的荧光值）和TMB显色的吸光度差值∆A（∆A=A1-A0，A1、A0分别为加入毒素和超纯水后底物与TMB反应后的A450nm）作为信号输出，建立标准曲线。如图7A所示，随着AFB1质量浓度不断增大，GQDs的荧光不断恢复，恢复的荧光强度∆F与AFB1质量浓度在10-12～10-6g/mL范围内呈明显正相关，得到荧光信号的线性方程为∆F=928.733＋71.779lgC，R2=0.990 2，检出限计算为1.667×10-12g/mL。检出限的定义如下：3S0/S（3为置信水平为99%的因子，S0为空白测量的标准偏差（n=3），S为标准曲线的斜率）。由图7C可以看到，随着AFB1质量浓度不断增大，TMB氧化产物在450 nm波长处的吸光度逐渐减低，以AFB1质量浓度（C）为横坐标，∆A为纵坐标，在10-12～10-6g/mL范围内得到了比色信号的线性方程为∆A=-0.275-0.021lgC，R2=0.998 9，计算得到检出限为2.732×10-12g/mL。此外，通过AFB1检测方法与其他方法比较（表1）表明，本研究所得结果具有较宽的线性范围和更低的检出限，对AFB1具有良好的检测性能，可实现对AFB1的高灵敏便携检测。

表1 不同AFB1检测方法的比较Table 1 Comparison of different methods for the determination of AFB1

图7 AFB1检测灵敏度及特异性Fig.7 Sensitivity and specificity of AFB1 detection

探讨该方法对检测AFB1的特异性，选择与AFB1结构类似的毒素AFB2、AFM1、OTA、T-2毒素、Patulin、FB1、DON以及混合毒素进行验证。如图7B所示，只有AFB1和混合毒素才有明显的荧光信号响应，说明荧光信号有良好的特异性。如图7D所示，TMB氧化产物的颜色在有AFB1存在时最浅，说明比色信号对AFB1也具有良好的特异性。

2.7 实际样品中AFB1的检测分析

使用本方法对牛奶、大米、麦片、酱油和白醋共5 种实际样品中的AFB1进行检测，根据标准曲线计算得到样品中AFB1的含量，同时与商业化的ELISA试剂盒和HPLC进行方法对比，结果如表2所示。商业化的ELISA试剂盒检出了大米与酱油两种样品，含量分别为0.111、3.41×10-2μg/kg，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为2.7%、1.5%。HPLC只检出了大米一个样品，含量为0.100 μg/kg。本方法中比色信号检出了大米与酱油两种样品，而荧光信号检出了大米酱油和麦片3 种样品，比色信号检出大米、酱油中的AFB1含量分别为0.114、3.44×10-2μg/kg，RSD分别为2.2%、0.8%；荧光信号检出大米、酱油与麦片中的AFB1含量分别为0.108、3.26×10-2、1.94×10-3μg/kg，RSD分别为2.4%、1.2%、0.9%。两种信号的检测结果与ELISA试剂盒和HPLC所测得的结果保持在同一水平，且RSD均小于3%，说明检测结果具有一定的准确性。此外，两种信号能测出ELISA试剂盒和HPLC未能检出的样品，说明本方法能有效地检测出实际样品中的AFB1含量并且比传统方法的灵敏度更高。两种信号得到的结果可以看到本方法中荧光信号的灵敏度更高。

表2 不同方法检测实际样品中AFB1的含量Table 2 Comparison of results of AFB1 detection in real food samples by different methods

为进一步验证本方法的实际应用性能，在牛奶中添加不同含量的AFB1标准液制备不同质量浓度的AFB1牛奶加标样品进行加标回收率实验。如表3所示，比色信号与荧光信号均有效检出，并与加标含量几乎持平。其中比色信号的加标回收率为96.03%～112.27%，荧光信号回收率为91.50%～117.20%，两种信号的RSD均小于3%，说明本方法具有很好的准确性和特异性，可用于牛奶等相关实际样品中AFB1的检测。

表3 牛奶样品中AFB1加标回收率Table 3 Recoveries of AFB1 in spiked milk samples

3 讨论

将GSH和AFB1-Apt富集在SiO2NPs表面制备了SiO2NPs@GSH@Apt识别探针，MnO2NPs与GQDs偶联复合成MnO2NPs@GQDs信号读出底物，Apt和抗体组合识别目标物AFB1。在聚苯乙烯微孔板上，基于探针上GSH与底物的反应设计了一种具有比色/荧光双信号的AFB1检测方法，实现了AFB1的可视化比色及荧光信号高灵敏检测。两种信号得到的结果互相佐证，避免了单信号输出时容易出现假阳性的后果。Apt与抗体共同识别捕获目标物，避免其他毒素干扰，具有良好的特异性，且相较2 个抗体组合使用的成本更低。与商业化ELISA试剂盒和HPLC相比，本方法具有更高的灵敏度，可用于痕量检测AFB1，为食品安全快速、灵敏检测提供了技术支撑。