蛋白酶体及其介导的泛素-蛋白酶体途径对宰后秦川牛肉蛋白的降解作用

胡丽筠，张 倩，陈雪妍，王金霞，李 荣，李亚蕾，罗瑞明

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750000）

牛肉在宰后成熟期间由于受自身肌肉组织生物化学变化的影响，导致肌肉品质发生一系列的变化，这些生物化学变化主要包括内源酶激活、结构蛋白降解等[1]。蛋白酶体是一种多亚基蛋白酶复合物，使细胞质和细胞核中的蛋白质发生降解[2]，主要负责分解细胞中受损和不正确折叠的蛋白质以及一些调节蛋白[3]，在真核生物中80%～85%的蛋白质都是通过泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）进行降解[4]。蛋白酶体介导的UPP作为真核细胞中蛋白水解和细胞器清除的主要途径，高度复杂，以特定方式参与细胞内蛋白质降解[5]。牛肉在宰后贮藏过程中由于肌肉组织代谢导致肌肉组织蛋白发生降解，进而影响其嫩度。MG-132是一种可逆性肽醛类蛋白酶体抑制剂，可进入细胞中抑制蛋白酶体活性，从而抑制UPP介导的蛋白质降解[6]。

Taylor等[7]提出UPP在肉嫩化中发挥作用。曾珍[8]研究发现猪肉中20S蛋白酶体与剪切力、系水力相关。Liu Yue等[9]研究发现UPP在宰后羊肉蛋白水解中发挥作用，并可能有助于肉的嫩化。Zhang Bailin等[10]研究补充丙氨酰-谷氨酰胺对猪仔泛素化蛋白分解的信号通路影响，发现补充丙氨酰-谷氨酰胺通过上调蛋白质合成和下调泛素化蛋白分解、蛋白质降解改善猪仔的生长性能。Furukawa等[11]研究了热应激鸡肌肉蛋白降解的过程变化，推测热应激引起的肌肉蛋白降解可能是由于atrogin-1激活泛素化，这一过程可能参与线粒体活性氧的产生和皮质酮的分泌。这些研究说明UPP对肉质形成的潜在作用。与其他蛋白质翻译后修饰相比，对UPP作用于肉质的研究较少，需要进一步的研究阐明这种为改善肉质提供基础的机制。因此，本研究通过对宰后秦川牛背最长肌注射或不注射MG-132，提取不同时间点样品中的蛋白，测定宰后过程中蛋白的降解情况、泛素蛋白含量、蛋白酶体活性以及微观结构变化，研究蛋白酶体介导的UPP是否对宰后秦川牛肉产生影响，以期为泛素依赖性蛋白的降解途径影响宰后秦川牛肉品质的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

25 月龄左右的去势秦川公牛，购于宁夏尚农生物科技产业发展有限公司。

BCA试剂盒 江苏碧云天公司；蛋白酶抑制剂德国Calbiochem公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、蛋白酶体抑制剂（MG-132）美国Merck公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）上海麦克林生化科技股份有限公司；蛋白酶体ELISA检测试剂盒 上海恒远生物科技有限公司；钙蛋白酶活性、泛素蛋白ELISA检测试剂盒 江苏酶免实业有限公司。

1.2 仪器与设备

NAI-CS150超声波细胞破碎机 上海那艾精密仪器有限公司；Mini Vac Alpha冷冻离心机 美国Scan Speed公司；ML204/O2电子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；352型酶标仪 芬兰Labsystems Multiskan MS公司；Power PacTM基础电泳仪 美国Bio-Rad Laboratories公司；TS-2水平脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Fluor Chem FC2凝胶成像系统 美国Alphalnnotech公司；JEM-1400FLASH透射电子显微镜日本电子株式会社；EM UC7超薄切片机 德国徕卡公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

分别取3 头生长发育正常、体壮无病、25 月龄左右的去势秦川公牛的背最长肌，在屠宰后立即沿垂直于肌纤维方向分割成120 g的肉样，将样品分别进行注射处理。

处理组：宰后立即注射蛋白酶体抑制剂（MG-132先用微量的DMSO制成储备液，再配制成5 μmol/L溶液）；对照组：注射与处理组中溶解MG-132相同体积的DMSO。每个肌肉样品平均分为4 个区域，整个样品中心和4 个区域的4 个中心均分别注入2.4 mL试剂，每块肉样共需注射12 mL试剂。

注射后，用保鲜膜和锡纸包裹样品，并置于透气性为23.5 g/（m2·d）的聚乙烯保鲜袋中。在4 ℃条件下贮藏0、2、4、6、8 d，进行实验时，不能立即测定指标，将手术刀及镊子进行灭菌处理后分别采集不同贮藏期样本10 g，并将其放置在液氮中速冻，置于-80 ℃超低温冰箱存放至待用。

1.3.2 蛋白酶体活性的测定

预冷后的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）冲洗组织，去除残留血液，称质量后将组织剪碎。组织与PBS按料液比1∶9（g/mL），并加入蛋白酶抑制剂，于冰上充分研磨。最后将匀浆液于5 000×g离心5～10 min，取上清液进行检测。实验操作按照20S蛋白酶体ELISA检测试剂盒的要求进行，使用酶标仪于450 nm波长处进行测定。宰后贮藏0 d样品的蛋白酶体活性为100%，计算其余样品的蛋白酶体相对活性。

（c）The farmer，whose name was Fred，sold us 10 pounds of potatoes.

1.3.3 钙蛋白酶活性的测定

将组织加入适量生理盐水捣碎，3 000 r/min离心10 min取上清液进行检测。实验操作按照钙蛋白酶活性ELISA检测试剂盒的要求进行，使用酶标仪于450 nm波长处进行测定。宰后贮藏0 d样品的钙蛋白酶活性为100%，计算其余样品的酶相对活性。

1.3.4 背最长肌总可溶性蛋白溶解度测定

参考Joo等[12]方法，从宰后4 ℃贮藏0、2、4、6、8 d秦川牛背最长肌样品中提取总可溶性蛋白，并参考马旭华等[13]方法测定蛋白含量，绘制标准曲线y=5.761 4x＋0.012 4（R2=0.997 3），y为吸光度，x为蛋白质溶解度（mg/g）。

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

根据马旭华等[13]和黄峰[14]方法对样品进行处理。制备质量分数5%的浓缩胶和质量分数12%的分离胶，将所得上清液的蛋白质质量浓度调至1.00 mg/mL，样品缓冲液（2×）7.5 µL、蛋白质溶液样品15 µL加入聚合酶链式反应管中混匀煮沸加热5 min，室温冷却后加入到上样孔中。蛋白Marker（10～250 kDa）加入10 µL。浓缩胶电流设置为15 mA，分离胶电流设置为25 mA，溴酚蓝跑到底部、蛋白Marker不同条带均分离后关闭电源，电泳完成。小心取出凝胶置于培养皿中加入考马斯亮蓝R-250，50 r/min摇床染色1 h后脱色，脱色剂更换3～5 次，每30 min更换1 次。脱色完成后置于凝胶仪中成像。

1.3.6 泛素蛋白含量的测定

样品处理同1.3.3节，实验操作按照泛素蛋白ELISA检测试剂盒的要求进行，使用酶标仪于450 nm波长处进行测定。宰后贮藏0 d样品的泛素蛋白含量为100%，计算其余样品的泛素蛋白含量。

1.3.7 微观结构观察

参考姬探等[15]的方法，取不同贮藏期的样品，切成20 mm×20 mm×20 mm的块状，用质量分数3%的戊二醛进行预固定，用质量分数1%四氧化锇进行再固定。使用丙酮溶液脱水，脱完水的样品先后经过环氧树脂（型号为Epon812）和脱水剂进行渗透包埋，用超薄切片机制备约50 nm厚的切片，在室温条件下用醋酸铀和枸橼酸铅先后染色，用透射电镜拍照并观察。观察倍数为12 000 倍。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 蛋白酶体活性的变化

由图1可知，随着宰后贮藏时间的延长，对照组和MG-132组的蛋白酶体活性显著降低（P＜0.05），这与Zhang Yuemei等[16]研究宰后贮藏期间猪腰肉的蛋白酶体活性变化结果一致。两组实验结果存在差异，其中MG-132组的蛋白酶体活性总体低于对照组，表明MG-132对宰后秦川牛肉中蛋白酶体活性有抑制作用。

图1 贮藏期间蛋白酶体活性变化Fig.1 Change in proteasome activity during storage

2.2 钙蛋白酶活性的变化

钙蛋白酶系统对肉的成熟嫩化具有重要作用。钙蛋白酶能够水解肌肉组织中肌纤维蛋白等其他细胞骨架蛋白[17]。由图2可知，随着宰后贮藏时间的延长，对照组和MG-132组的钙蛋白酶活性显著降低（P＜0.05），两组实验结果相似，其数值无显著差异，表明MG-132对宰后秦川牛肉中钙蛋白酶活性没有抑制作用。

图2 贮藏期间钙蛋白酶活性变化Fig.2 Change in calpain activity during storage

2.3 总可溶性蛋白含量的变化

由图3可知，随着宰后贮藏时间的延长，对照组和MG-132组的总可溶性蛋白含量显著降低（P＜0.05），两组实验结果存在差异，其中MG-132组的总可溶性蛋白含量高于对照组，这是由于MG-132抑制了宰后秦川牛肉中蛋白酶体活性，导致蛋白酶体对宰后牛肉蛋白的降解作用受到抑制，表明MG-132对宰后秦川牛肉中总可溶性蛋白的降解有抑制作用。

图3 贮藏期间总可溶性蛋白的含量变化Fig.3 Change in total soluble protein content during storage

采用SDS-PAGE分析秦川牛背最长肌蛋白质降解情况，根据秦川牛背最长肌蛋白分子质量选择10～250 kDa为蛋白Marker指示范围，共有9 条带。电泳前在每个凹糟中加入等浓度的溶液，保证蛋白降解变化影响条带的颜色和宽度。由图4可知，随着宰后贮藏时间的延长，MG-132组与对照组内蛋白条带的变化有所不同。对照组宰后0～8 d可以观察到总体高分子质量条带逐渐变浅，低分子质量条带逐渐变深，结合图3结果可知秦川牛背最长肌总可溶性蛋白出现降解现象。MG-132组的蛋白条带相比于对照组，可以观察到更加清晰蛋白条带，40～250 kDa之间的蛋白条带显著比对照组深，且有一些条带比对照组宽；但在20～35 kDa内贮藏8 d的I总蛋白条带比对照组浅，这可能是因为MG-132的抑制作用，诱导宰后肌细胞凋亡以及细胞自噬，使部分蛋白有限地降解[18-19]。通过比较宰后秦川牛背最长肌对照组和MG-132组的SDS-PAGE结果，发现MG-132通过抑制宰后牛肉蛋白酶体的活性，改变了宰后牛肉蛋白的降解，说明蛋白酶体参与了宰后肌肉蛋白的水解过程。

图4 贮藏期间总可溶性蛋白降解Fig.4 Degradation of total soluble proteins during storage

2.4 泛素蛋白含量的变化

由图5可知，随着宰后贮藏时间的延长，对照组和MG-132组的宰后秦川牛背最长肌蛋白的泛素蛋白含量在宰后2 d显著下降后（P＜0.05），出现升高后降低的趋势，这可能是由于宰后肌肉中泛素化修饰的蛋白聚合物被分解成许多不同长度的泛素单体或泛素缀合物，导致泛素蛋白含量短暂升高；贮藏期间MG-132组的泛素蛋白含量高于对照组，两组实验结果存在差异。表明MG-132通过抑制蛋白酶体活性，抑制了宰后UPP，使得宰后泛素蛋白含量升高[20]，说明该途径在宰后依然起作用。

图5 贮藏期间泛素蛋白含量变化Fig.5 Change in ubiquitin content during storage

2.5 微观结构变化

在贮藏过程中宰后牛背最长肌微观结构的变化如图6所示。宰后贮藏0 d，对照组牛背最长肌肌节清晰完整，肌纤维排列整齐，肌细胞之间排列较为紧密，Z线结构明显。随着贮藏时间延长，肌纤维的结构被破坏，排列较为松散，Z线结构开始模糊，肌原纤维断裂程度逐渐加重，肌原纤维之间产生较大的缝隙，与刘吉娟[21]研究宰后滩羊结构变化结果一致。宰后贮藏0 d，MG-132组的牛背最长肌结构与对照组之间无区别，随着贮藏时间延长，MG-132组的牛背最长肌结构保留较好，Z线以及明暗带的边界都比对照组清晰。表明抑制蛋白酶体可以减少肌肉超微结构的破坏，说明蛋白酶体在宰后贮藏过程中可使肌原纤维结构发生降解。

图6 贮藏期间微观结构的变化Fig.6 Change in microstructure during storage

2.6 总可溶性蛋白与泛素蛋白含量的相关分析

为了进一步探究宰后贮藏期间秦川牛背最长肌中UPP是否对肉品质产生影响，对对照组的总可溶性蛋白与泛素蛋白含量进行Pearson相关性分析。由表1可知，宰后贮藏期间总可溶性蛋白与蛋白酶体活性呈极显著正相关（P＜0.01），与泛素蛋白含量呈显著正相关（P＜0.05），说明宰后牛背最长肌蛋白降解与泛素蛋白含量变化有着密切的关系。

表1 总可溶性蛋白与泛素化水平的相关性分析Table 1 Correlation analysis between proteasome activity and ubiquitin content

3 讨论

真核细胞内蛋白质的3 种主要降解途径有UPP、自噬溶酶体途径、钙蛋白酶途径[22]，蛋白酶体是UPP中催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶，包括20S蛋白酶体和26S蛋白酶体[23]。MG-132是一种醛基肽类特异性蛋白酶体抑制剂，是目前公认的UPP蛋白酶体抑制剂，可快速进入细胞，抑制蛋白酶体活性[24]。本研究发现随着贮藏时间的延长，蛋白酶体活性显著降低（P＜0.05），对照组较MG-132组活性较高，说明本实验注射的5 μmol/L MG-132对宰后秦川牛背最长肌的蛋白酶体活性有一定抑制作用。虽然蛋白酶体可能与早期肌原纤维去稳定无关[25]，但是在宰后贮藏后期的牛背最长肌中蛋白酶体依然保持高活性，对肉质有重要影响，蛋白酶体的稳定性，使它们能够在机体死后与其他蛋白水解系统协同作用，在肉嫩化中发挥作用[26]。由于钙蛋白酶也可以影响水解蛋白的结果[27]，一定浓度的MG-132会抑制钙蛋白酶活性，因此，为排除钙蛋白酶活性对实验结果的影响，测定对照组和MG-132组的钙蛋白酶活性。结果表明，抑制剂并没有影响钙蛋白酶的活性，实验观察到的蛋白降解以及肌原纤维结构的差异与钙蛋白酶无关，因此，在后续实验中发挥作用的是蛋白酶体。

随着宰后贮藏时间的延长，MG-132组的总可溶性蛋白含量高于对照组，表明MG-132对宰后秦川牛肉中总可溶性蛋白的降解有抑制作用。结合SDS-PAGE结果分析可知，对照组的秦川牛背最长肌总可溶性蛋白出现明显降解现象，高分子质量蛋白逐渐被降解，低分子质量蛋白逐渐累积。40～250 kDa内的MG-132组蛋白条带显著深于对照组，且蛋白条带更加清晰；在20～35 kDa内有蛋白条带比对照组浅，这可能是因为MG-132的抑制作用，诱导宰后肌细胞凋亡以及细胞自噬参与部分蛋白的有限降解；在35～70 kDa内蛋白条带比对照组深，已知肌动蛋白、原肌球蛋白分子质量在该范围内，已鉴定出蛋白酶体的潜在底物有肌动蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白[28]，肌球蛋白是骨骼肌中丰富的肌原纤维蛋白，具有收缩功能和调节功能，尤其是在骨骼肌的收缩功能上发挥重要作用，肌动蛋白等关键结构蛋白的水解和肌节变化是导致宰后成熟过程中肉质嫩化的主要原因[29-30]；随着贮藏时间延长，肌动蛋白、肌球蛋白等肌原纤维蛋白的持续降解促使肌原纤维之间形成间隙，并随降解程度加剧，缝隙越来越宽。MG-132组的宰后牛背最长肌的微观结构保留较好，Z线、M线以及明暗带的边界都较对照组清晰。综上所述，蛋白酶体可以降解宰后牛肉总可溶性蛋白，并且在宰后贮藏过程中使肌原纤维结构发生降解，参与宰后肌肉蛋白的水解过程，改变宰后肌肉的超微结构，影响宰后嫩度。

宰后秦川牛背最长肌的泛素蛋白含量发生变化，MG-132组的泛素蛋白含量总体高于对照组，表明蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性，抑制宰后泛素化蛋白的UPP降解，使得泛素蛋白含量升高；对总可溶性蛋白与泛素蛋白含量进行Pearson相关性分析，发现宰后贮藏期间总可溶性蛋白与蛋白酶体活性呈极显著正相关（P＜0.01），与泛素蛋白含量呈显著正相关（P＜0.05），说明宰后蛋白降解与泛素蛋白含量变化有着密切的关系。UPP在宰后调理期间保持活跃[26]，此外，骨骼肌中的主要降解系统之一是UPP，它选择性地降解蛋白质[32]。Liu Yue等[9]研究发现UPP途径对宰后羊肉成熟发挥作用，影响肌肉收缩；表明蛋白酶体介导的UPP通过对宰后泛素蛋白的降解，影响宰后蛋白的降解，说明宰后UPP对肉质形成具有潜在作用。综上所述，宰后秦川牛肉背最长肌中蛋白酶体除了可以单独地降解蛋白，破坏宰后肌原纤维结构，还可以通过UPP影响泛素依赖性蛋白的降解，进一步影响宰后牛肉蛋白的降解。

4 结论

本研究通过对宰后秦川牛背最长肌注射或不注射蛋白酶体抑制剂MG-132，提取不同贮藏时间样品中的蛋白，研究宰后秦川牛背最长肌在贮藏过程中蛋白的降解情况、泛素蛋白含量、蛋白酶体活性以及微观结构变化，得到以下研究结论：随着宰后贮藏时间的延长，MG-132组中的蛋白酶体活性总体低于对照组，总可溶性蛋白、泛素蛋白含量总体高于对照组；SDS-PAGE结果显示，MG-132组在40～250 kDa之间总可溶性蛋白的蛋白条带整体深于对照组；MG-132组的牛背最长肌结构保留较好，Z线以及明暗带的边界都较对照组清晰，且总可溶性蛋白与泛素蛋白含量变化呈显著正相关（P＜0.05）。综上所述，MG-132对宰后秦川牛肉中蛋白酶体有抑制作用，改变了宰后牛肉蛋白的降解，抑制宰后牛肉UPP中泛素化蛋白的降解，减少肌肉结构的破坏，说明宰后UPP对肉质形成具有潜在作用，宰后秦川牛肉背最长肌中蛋白酶体除了可以单独降解蛋白，破坏宰后肌原纤维结构，还通过介导UPP影响泛素依赖性蛋白的降解，最终影响宰后牛肉的品质。