宰后不同冷却方式对荷斯坦公牛背最长肌嫩度的影响

李晶晶，张瑞红，王吉人，董洋洋，俞龙浩

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

宰后不同冷却方式对荷斯坦公牛背最长肌嫩度的影响

李晶晶，张瑞红，王吉人，董洋洋，俞龙浩

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

为了比较不同冷却方式对荷斯坦公牛背最长肌嫩度特性的影响，取4头公牛背最长肌，左侧传统冷却4℃放168 h，右侧三段冷却依次放入（4℃4 h，16℃4 h，4℃160 h）。结果显示，宰后8、12、24 h处理组pH值低于对照组（P＜0.05），处理组的ATP含量和肌节长度在宰后4 h和8 h之后低于对照组（P＜0.05），1、7、14、21 d处理组剪切力值低于对照组（P＜0.05），48 h后处理组MFI高于对照组（P＜0.05）。结果表明，相比传统冷却法，三段冷却法使宰后荷斯坦公牛品质得到进一步提升。

荷斯坦公牛；冷却方式；嫩度

牛肉的嫩度是决定牛肉食用的最重要因素，也是消费者选购肉制品的重要指标。其中除了牛肉的品种，年龄等一些生理因素对嫩度有影响外，最主要的还是宰后冷却方式对牛肉嫩度的影响。一般的冷却方式有常规冷却，快速冷却，延迟冷却等等，而三段冷却法不同于上述一般冷却方式。三段冷却法是目前研究较新的一种方法，即将宰后胴体放在三个不同层次温度下进行冷却加工，使牛肉成熟过程加快，进而提高肉的嫩度。Hollung等[1]研究发现，将宰后挪威红牛背最长肌在12℃冷却10 h后，再贮藏在4℃，其剪切力值要显著低于一直在4℃贮藏的对照组，表明处理组的嫩度比对照组明显提高很多，加快了肉的嫩化过程。同时，Yu等[2]研究表明将Hanwoo牛背最长肌（西冷）依次贮藏在24℃，4 h；12℃，4 h；2℃，16 h，其肌节长度要比常规冷却（2℃，24 h）增加，剪切力值减低。Li等[3]研究宰后不同的冷却温度对中国黄牛嫩度影响的实验表明，在宰后1 d温度为14℃比0和7℃有较长的肌节长度，差异性显著。目前对于宰后不同冷却处理的中国荷斯坦公牛的却鲜有研究报道，由此选取了的中国荷斯坦公牛背最长肌进行宰后不同冷却方式的处理，探讨三段冷法和传统冷法对其宰后嫩度的影响。

1 试验材料与方法

1.1 试验动物

中国荷斯坦公牛（黑龙省大庄园肉业有限公司）。

1.2 试验试剂与设备

主要试剂：HClO4（Sigma公司）、三乙胺磷酸（Sigma公司）、2%戊二醛（天津市大茂化学试剂厂）、100 mmol·L-1KCl（Sigma公司）、11.2 mmol·L-1K2HPO4（天津市大茂化学试剂厂）、8.8 mmol·L-1KH2PO4（天津市大茂化学试剂厂）、1 mmol·L-1EGTA（Sigma公司）、1 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1NaN3（Sigma公司）。

主要试验仪器：均质机（FA25，FLUKO）、离心机（5417R，Eppendorf，Germary）、紫外可见分光光度计（specord 210 plus，德国耶拿分析仪器有限公司）、移液枪（1000/200/100/20/10/2μl，Eppendorf，Germary）、液氮生物容器（YDS-5-200，成都金凤）、插入式温度计（TR-52，Thermo Recrdor）、电子天平（AR233CN/ CAV214C，OHAUS）、计时器（Eppendorf）、手提式pH（pH-K21，KBinar GmbH，Landsberg，Germany）、氦氖激光衍射器（Model No.212-2，Spectra-physics，USA）、质构仪（TA-XT2i，Stable Micro Systems，UK）。

1.3 试验方法

1.3.1 取样

将4头荷斯坦公牛（540 kg±500 g）在黑龙江省大庄园肉业产业园的屠宰场按照商业屠宰工艺进行屠宰。背最长肌左边的部分作为对照组，放在4℃的温度下，存放168 h；背最长肌右边的部分作为处理组，依次放在4℃下4 h，16℃下4 h，4℃下160 h。在宰后0、4、8、12、24、48、72、168 h分别在荷斯坦公牛的背最长肌左右部分中进行取样，测定胴体中心温度、pH、ATP含量、肌节长度、剪切力以及肌原纤维碎片（MFI）。

1.3.2 胴体中心温度测定

宰后冷却室的温度和胴体的中心温度是利用thermometer温度计测定，将数字温度计探针插入牛背最长肌5 cm深，每5分钟自动记录数据。

1.3.3 pH值测定

用手提式pH仪测定宰后胴体的pH值，先将pH仪探头放入到pH值为4.6的缓冲溶液中，光亮显示3次后，摁住“ENT”，当显示为0时，拿出放入第二个缓冲溶液中（pH值为7.0）同样操作后，自动回到“MEASURE”状态，准备待用。对所有选取的宰后时间点，0、4、8、12、24、48、72、168 h测定pH值。宰后不同冷却方式下胴体pH值依照Hopkins等[4]spline模型表示。

1.3.4 ATP、ADP和AMP含量测定

ATP、ADP和AMP含量测定是稍微修改Wang等[5]方法进行。取10 g经过液氮冷冻后的样品加入10%的HClO4溶液25 mL静置10 min，使用高速均质机在4℃，1 000 rpm下均质3 min，随后在0℃，15 000 rpm下离心10 min。上清液用5 mol·L-1的KOH调节pH值达到6.5，向其中加入10%的高氯酸使混合液达到100 mL，静止30 min，过滤，将上清液在0℃，10 000 rpm下离心10 min，使用滤膜器（0.45 μm）进行过滤。向色谱柱（Lichrospher RPC18，250×4.0 mm）中加入5 mL的上述滤液，非流动相加入1%三乙胺磷酸（pH 6.5），流速为1.5 mL·min-1，图的速度为0.5 cm·min-1，温度为40℃，在254 nm波长下测定化合物成分。

1.3.5 肌节长度测定

实验参照Voyle[6]等测定肌节长度方法使用氦氖激光衍射器进行测定。即顺着肌原纤维方向取1～2 g肉样放入2%的戊二醛溶液中保持30 min，在氦氖激光衍射器下记录肌节长度值。

1.3.6 剪切力测定

实验采用Warner-Bratzler法测定样品的剪切力值。在宰后1、7、14、21 d取300 g肉样放入塑料袋，水浴加热至中心温度75℃，保持30 min，然后取出在0～4℃冰箱过夜。用直径1 cm的中空取样器沿肌纤维方向取样（注意避开筋腱），用TA-XT2i型质构仪垂直肌纤维方向测定每个肉柱的最大剪切力值。同一肉块所有的剪切力值的平均值即为该肉块的最大剪切力值，参数为：测试速度5 mm·sec-1，触发力5 g，载物重30 kg。

1.3.7 肌原纤维小片化（MFI）测定

参考Olson等[7]的方法修改测定。剪取待测定的牛肉样品4 g，修整去除脂肪和结缔组织后放入100 mL烧杯中，加40ml预冷（2℃）的MFI缓冲液（100 mmol·L-1KCl，11.2 mmol·L-1K2HPO4，8.8 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1EGTA，1 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1NaN3），于冰浴中高速匀浆三次（10 000 rpm），每次30 S，匀浆后在2℃，1 000×g条件下离心15 min，弃去上清液，加入5倍体积的MFI缓冲液将沉淀悬浮，悬浮液用18目聚乙烯滤网过滤除去结缔组织。利用Bradford法测滤液蛋白质浓度，将悬浮液的浓度调整到0.5 mg·mL-1，在540 nm波长度测定其吸光度。每个样品一式三份，每份样品三个重复同时进行。

MFI=O.D.at 540 nm×200

1.3.8 数据分析

使用SAS软件（SAS Institute，Cary，NC）对宰后pH、ATP含量、肌节长度、剪切力、MFI进行差异性分析，采用origin（Origin Lab，USA）软件对胴体中心温度、pH和肌节长度进行作图。样品在同一宰后时间做三组重复，不同处理间的差异性用（P＜0.05）表示，所有的数据均以中间值±标准误来表示。

2 结果与讨论

2.1 宰后不同冷却方式对牛背最长肌中心温度变化影响

图1表示宰后不同冷却方式对宰后牛背最长肌中心温度的影响。其中，传统冷却法（对照组）与三段冷却法（处理组），基于splines拟合曲线表明，在宰后0～4 h内，两组胴体中心温度迅速下降，在宰后16 h对照组下降到1.6℃，而处理组胴体中心温度在宰后4～8 h维持在16.7±0.5℃，而后在18 h下降到1.6℃。

图1 宰后不同冷却方式下牛背最长肌胴体中心温度变化spline拟合曲线Fig.1Lines of best fit based on spline modelling of center temperature for control（solid）and treatment（dotted）on postmortem M.longissimus of beef

Frylinck等[8]报告，温度和pH值对牛肉僵直开始和肉嫩度起重要作用。Medellin-Lopez等[9]报告，肌肉pH值低于6.2之前，肌肉温度降到10℃以下容易发生冷收缩，肌肉温度16℃时，冷收缩程度很小。Rhee[10]等和Lonergan等[11]还有研究指出牛宰后胴体温度下降至10～15℃后，在此温度下保持6 h，然后降到4℃以下，这样可以防止冷收缩，并能有效抑制胴体表面微生物的生长。

2.2 宰后不同冷却方式对牛背最长肌pH值的影响

动物屠宰后呼吸活动和心脏跳动停止，实际上被切断了外部营养供应以及氧气的输送，肌糖原的新陈代谢由有氧代谢转成无氧酵解，无氧酵解结果使乳酸不断积累，导致宰后肌肉pH值下降。图2表示宰后不同冷却方式对牛背最长肌pH值的影响。基于spline模型拟合曲线结果显示，随着宰后贮藏时间的增加，无论是处理组还是对照组，pH值都呈显著下降趋势。但是，宰后8、12、24 h处理组pH值显著低于对照组（P＜0.05）。与宰后4 h pH值比较，处理组分别下降了0.64、0.81、0.9，而对照组分别下降了0.20、0.47、0.79。尤其是宰后8 h和12 h处理组pH值下降幅度显著大于对照组。这是由于在实验中宰后4 h到8 h处理组冷却环境温度从0℃提高到16℃，使肌肉中心温度大约维持在16℃，加速了无氧酵解过程的结果。此结果与yu等[2]研究报告基本一致。同时Pike[12]等指出肌肉的最终pH值主要是受糖原降解情况的影响，而与降解相关的因素即肌糖原本身的含量即肌糖原含量高，肌肉最终pH值可能较低。

图2 宰后不同冷却方式对牛背最长肌pH的影响Fig.2Lines of best fit based on spline modelling of pH forcontrol（black circles）and treatment（open circles）on postmortem M.longissimus of beef

2.3 宰后不同冷却方式对牛背最长肌ATP含量的影响

表1表示宰后不同冷却方式对牛背最长肌ATP含量的影响。结果表明，宰后4 h为止处理组和对照组基本维持同一水平，但是宰后8 h对照组ATP水平显著低于处理组。虽然宰后24 h与0 h相比，处理组的ATP值下降了72%，对照组下降了83%，但到宰后24 h达到了同一水平。ATP水平的降低可能引起肌肉僵直开始。在实验中对照组宰后8 h ATP水平显著低于处理组，暗示着对照组可能比处理组先进入肌肉僵直阶段，同时测定在宰后8 h肌节长度结果中显示对照组的肌节长度显著小于处理组（图3），符合前人研究的ATP水平决定肌肉僵直起始点的报告[5]。Kuda等[13]研究表明随着宰后无氧酵解的进行，乳酸积累使pH降低，导致肌质网Ca2+束缚能力下降，流出的Ca2+激活肌球蛋白前段结合的ATP酶，使ATP分解，导致ATP值迅速降低。然而在实验测定结果，宰后4 h后处理组的pH值下降速度显著快于对照组，但是宰后8 h的处理组ATP含量却显著高于对照组，这可能是由于处理组采用三段冷却处理，使宰后4 h到8 h时间段肌肉温度维持在16℃附近，避免冷收缩的发生，缓和了迅速消耗ATP的结果。同时若哺乳动物的红色肌肉在僵直前肌肉温度迅速降低时，由于线粒体机能降低释放出较多的Ca2+，从而更容易引起冷收缩[14]。同时，ADP和AMP在贮藏期间的变化结果与ATP水平变化相吻合。

表1 宰后不同冷却方式在0、4、8、24 h对牛背最长肌ATP变化的影响Table 1Effect of different chilling methods on ATP，ADP and AMP of M.longissimus in beef at 0，4，8 and 24 h postmortem

2.4 宰后不同冷却方式对牛背最长肌肌节长度的影响

图3显示了宰后不同冷却方式对牛背最长肌肌节长度的影响。

图3 宰后不同冷却方式对牛背最长肌肌节长度的影响Fig 3Lines of best fit based on spline modelling of sarcomere length for control（black circles）and treatment（open circles）on postmortem M.longissimus of beef

在实验中宰后4 h后对照组的肌节长度均显著小于处理组（P＜0.05）。对照组的肌节长度在宰后4 h后到24 h为止急剧缩短，缩短幅度为0.67 μm，而处理组在此期间只缩短了0.19 μm。这可能是由于传统冷却方式下肌肉可能引起冷收缩的结果[2]。而处理组在此期间较小的收缩程度表明，三段冷却处理方式可以避免冷收缩的发生，同时可能缓和宰后僵直收缩程度。另外，宰后24 h到168 h为止处理组的肌节长度仍然显著大于对照组，说明即使经过较长时间的成熟过程宰后肌肉的强烈收缩也很难达到僵直期间有效抑制的程度，从而可能影响肉的嫩度改善。

2.5 宰后不同冷却方式对牛背最长肌剪切力的影响

在实验中测定剪切力值结果如图4所示。在宰后1、7、14、21 d处理组的剪切力值显著低于对照组（P＜0.05），显示出随成熟时间增加，其嫩度差异更加明显的现象。这与图3中测定的处理组中肌节长度下降缓慢相符合。但是随着宰后成熟时间的延长，处理组和对照组之间肌节长度差异是逐渐减小的，而却出现剪切力差异性反而变大的现象，这一现象暗示，随着成熟时间的延长，肌节长度对嫩度的影响越来越小，其他影响嫩度的因素会越来越多，且更复杂。

图4 宰后不同冷却方式对牛背最长肌剪切力变化的影响Fig 4Changes in M.longissimus postmortem shear force using conventional（control）and three-step chilling（treatment）methods

2.6 宰后不同冷却方式对牛背最长肌MFI变化的影响

肌原纤维小片化指数作为肌原纤维断裂程度的重要指标，且与肉的嫩度相关[15-17]。实验中肌原纤维小片化指数测定结果如图5所示。到宰后24 h为止，处理组和对照组均未显著增加，其后才开始显著增加。到48 h以后处理组肌原纤维小片化指数显著高于对照组（P＜0.05）。这一结果与剪切力测定结果基本一致，且表明在宰后三段处理方式中，可能加速肌原纤维小片化进程，从而有利于嫩度改善。同时表明，随着宰后成熟时间的延长，肌原纤维断裂进程的因素对嫩度的影响可能更重要。

图5 宰后不同冷却方式对牛背最长肌MFI变化的影响Fig 5Changes in M.longissimus postmortem MFI using conventional（control）and three-step chilling（treatment）methods

3 结论

宰后初期，与传统冷却法相比，三段冷却法由于在宰后4～8 h期间胴体中心温度维持在16℃左右，加速了宰后代谢过程，导致其背最长肌的pH值下降迅速（P＜0.05），这将有利于抑制胴体表面微生物的生长繁殖，同时使ATP下降趋与缓慢，有效地延迟肌肉僵直的起始时间。与传统方法相比三段冷却法处理的背最长肌的肌节长度大、肌原纤维小片化指数高，剪切力低且差异显著（P＜0.05）。此结果表明，与传统冷却法相比，三段冷却法可以使荷斯坦公牛背最长肌得到更高的嫩度，使宰后荷斯坦公牛肉的品质得到进一步提升。

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Effect of Different Chilling Methods on Tenderness in M.longissimus lumborum of Holstein Bulls

Li Jingjing，Zhang Ruihong，Wang Jiren，Dong Yangyang，Yu Longhao
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To compare the effect of different chilling methods on tenderness in M.longissimus lumborum of Holstein bulls.The left sides of carcasses were chilled for 168 h at 4℃（conventional chilling）as controls.The right sides of carcasses were chilled for 4 h at 4℃，4 h at 16℃and 160 h at 4℃（three-step chilling method）as the treatment samples.The results indicated that the pH of treatment was lower than the control at 8 h，12 h and 24 h postmortem（P＜0.05）.Sarcomere length and ATP was much greater in treatment group than control group at 4 h，8 h postmortem（P＜0.05），respectively.The MFI of treatment was higher than the control（P＜0.05）.The shear force of treatment was lower than the control（P＜0.05）on days 1，7，14，21 postmortem（P＜0.05）.The results suggested that 3-step chilling method might improve quality of Holstein bulls compared to the traditional three-stage chilling method.

Holstein bulls；chilling methods；tenderness

TS251.4

A

1002-2090（2017）01-0054-05

2015-11-15

国家自然基金（31171712）。

李晶晶（1990-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2013级硕士研究生。

俞龙浩，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：meat2011@126.com。