基于网络药理学探讨苍术-黄柏药对治疗糖尿病肾病的作用机制*

陈 莉，安海燕，张承承，郭晓媛

北京中医药大学东方医院，北京 100078

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的常见慢性微血管并发症之一，也是世界范围内终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要病因。一项对中国北京地区DKD 患者长达12 年的随访研究发现，DKD 患者通常面临着更高的死亡风险和更短的预期寿命［1］，生活质量严重下降，对DKD的早期预防与合理治疗应得到高度重视。西医治疗DKD 主要包括降糖、降压、降脂、控制尿蛋白、限制蛋白摄入等，药物应用主要以血管紧张素转化酶抑制剂及血管紧张素受体拮抗剂为主，但这些治疗是否能延缓ESRD 的进展尚不明确［2］。近些年来，对中医药治疗DKD的相关研究越来越多，且临床方面证明具有良好疗效［3-4］。

DKD 在中医古籍中并没有明确的病名记载，根据其临床表现中医将其归于“消渴”“尿浊”“浊毒”“水肿”等范畴。从湿热治DKD，中医古籍中也多有记载，《素问·奇病论篇》云：“此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也……转为消渴。”可见古人对于饮食不当损伤脾胃导致消渴早有认识。现代人随着生活质量的提高，喜食肥甘厚味，易损伤脾胃，导致纳运失职，生湿化热，此外，随病程发展，湿热可与其他病理因素，如痰浊、瘀血互结，导致DKD缠绵不愈。现代中医学者在治疗DKD方面有众多学说，例如络病论、伏邪论、癥瘕论、浊毒论等，但不论哪种理论均强调了湿热这一病理因素在DKD 病程中的作用，刘宝厚教授提出：“湿热不去，蛋白难消”的观点［5］，可见，在治疗DKD 时加入清热利湿药物具有一定理论依据。

苍术-黄柏药对源至二妙散，最早见于危亦林《世医得效方》，后于《丹溪心法》中改名为二妙散，具有清热祛湿功效。其中黄柏为君药，味苦性寒，苦以燥湿，寒以制温，长于清下焦湿热；苍术为臣药，味辛、苦，性温，为苦燥之品，长于入脾胃，既能健脾又能祛湿。两药合用，标本兼顾，能祛湿除热。研究表明，加入苍术和黄柏药对的中药方能明显改善DKD患者的蛋白尿和肾功能［6-7］。现采用网络药理学方法探讨苍术-黄柏治疗DKD的主要活性成分、作用靶点及信号通路，从现代微观角度更精准地揭示中医药治疗DKD的作用机制。

1 资料与方法

1.1 苍术-黄柏活性成分筛选及靶点信息收集基于中药系统药理学平台（http：//tcmspw.com/）检索苍术-黄柏药对的活性成分，以中药口服生物利用度（OB）≥30%及化合物类药性（DL）≥0.18 为筛选标准对活性成分进行筛选，并根据TCMSP获得的活性成分进一步收集对应靶蛋白，排除无法获得靶蛋白的活性成分。利用Uniprot 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）对检索出的蛋白化合物进行靶点预测，去除非人源靶点，并将之转化为基因名称。

1.2 疾病靶点获取在人类基因数据库Genecards（https：//www.genecards.org/）和 人 类 孟 德尔遗传数据库OMIM（https：//omim.org/）中输入“diabetic kidney disease”进行检索，获得疾病靶点后进行整合和去重处理，利用Venn 图将收集到的苍术-黄柏药对活性成分靶点与DKD 靶点取交集获得药对治疗DKD 的靶点，并制作“药物成分-靶点-疾病”网络图。

1.3 关键靶点筛选及蛋白互作网络（proteinprotein interaction，PPI）的构建将苍术-黄柏药对治疗DKD 的交集靶点导入STRING 11.0 版（https：//string-db.org/），限定研究种属为“homo sapiens”，最低相互作用阈值设为highest confidence（0.9），隐藏游离节点。获得蛋白互作关系后将结果导入Cytoscape 3.7.2 软件，利用MCODE插件按默认筛选标准筛选核心子网络，同时借“network analyzer”对子网络进行拓扑学分析。

1.4 核心靶点富集分析与可视化处理采用DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对苍术-黄柏药对治疗DKD 的核心靶点进行GO 基因与KEGG 信号通路富集分析，利用微生信（www.bioinformatics.com.cn）平台中富集气泡图对通路进行可视化处理。

2 结果

2.1 苍术-黄柏药对活性化合物及潜在作用靶点通过TCMSP 数据库检索苍术-黄柏药对的活性成分，排除无法获得潜在作用靶点的活性成分后共留下28 个活性成分，其中苍术4 个，黄柏24个，具体见表1。202个靶点用于后续研究。

表1 苍术-黄柏药对活性成分

2.2 苍术-黄柏药对防治DKD靶点通过人类基因数据库和人类孟德尔遗传数据库数据库收集疾病靶点并整合，最终共获得DKD 靶点3494 个，将苍术-黄柏药对潜在作用靶点与DKD 靶点取交集获得133个共同靶点，用于后续分析，见图1。

图1 苍术-黄柏药对靶点与DKD靶点Venn图

2.3 苍术-黄柏药对活性成分-潜在作用靶点-疾病网络构建及分析将上一步中筛选出的133 个潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件构建网络图，见图2。网络图中共162 个节点，353 条边。其中蓝色菱形部分为作用靶点，红色圆形部分为活性成分Mol 编号，绿色方形部分为药物名称（CZ苍术、HB 黄柏），节点间的连线代表二者之间的对应关系，连线越多提示该活性成分或作用靶点在网络中发挥作用越强，图中节点越大，表明节点度值越高。根据节点度值排名，排名前3 的活性化合物依次为MOL000098 槲皮素、MOL000173 汉黄芩素、MOL000358β-谷甾醇。

图2 苍术-黄柏药对活性成分-潜在作用靶点-疾病网络

2.4 PPI 网络构建与分析将133个交集靶点导入STRING 平台后获得PPI 网络图，见图3。将结果导入Cytoscape 软件进行可视化处理，利用MCODE插件按默认筛选标准共筛选出6个子网络，其中分值最高的子网络分数为42.941，共含有52个靶点，取该网络为核心子网络，其中所含靶点为核心靶点，见图4；该网络图共52个节点，1095条边，并利用“Network Analyzer”对该核心子网络进行拓扑分析，图中每个节点的大小代表其度值大小，颜色由绿变红表明节点度值越来越大，根据度值大小将排名前15的靶点展示出来，见表2。

图3 苍术-黄柏药对治疗DKD潜在作用靶点PPI图

图4 苍术-黄柏药对治疗DKD核心作用靶点子网络图

表2 苍术-黄柏药对治疗DKD的核心靶点

2.5 GO 基因及KEGG 信号通路富集分析通过David 数据库对2.4 步骤中筛选出的52 个核心靶点进行GO基因功能及KEGG通路富集分析，并根据P值＜0.05 进行筛选，其中生物过程（biological process，BP）有98 条，细胞组分（cellular component，CC）有9 条，分 子 功 能（molecular function，MF）16 条。按P值对生物过程、细胞组分及分子功能进行排名并分别取前5 位以柱状图的形式输出，见图5。可以看出苍术-黄柏药对治疗DKD 的生物过程主要包括对RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、脂多糖介导的信号通路、对细胞因子的反应、炎症反应等。细胞组分分析主要集中在细胞外空间、质膜外侧、细胞外基质、核、细胞溶质等。分子功能分析主要集中在细胞因子活性、生长因子活性、转录调控区DNA 结合、内肽酶活性、转录因子活性，序列特异性DNA结合等。

图5 苍术-黄柏药对治疗DKD的GO分析

对苍术-黄柏药对治疗DKD的核心交集靶点进行KEGG 富集分析，其中P值＜0.05 的通路共有88条，按P 值排序取排名前20 名的KEGG 通路以气泡图形式输出，结果见图6，主要包括各种癌症、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、TNF信号通路、甲型流感、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路等。

3 讨论

张介宾《景岳全书》云：“下消者，下焦病也，小便黄赤，为淋为浊，如膏如脂……其病在肾。”发病初期患者因饮食、环境致脾虚，脾为后天之本，肾为先天之本，先天有赖于后天之滋养，土生水，母病及子，最终致脾肾俱虚，病情加重。肾主水，肾虚则水失所主而妄行，脾虚运化失职则水湿积聚，水湿聚久化热灼伤肾络，加之脾肾亏虚肾精失固，外泄而成蛋白尿。以苍术、黄柏为主药的二妙散为治下焦湿热之代表方，其中苍术健脾燥湿，有补有泻，常用于湿阻中焦。药理学研究发现，苍术主要包括倍半萜类、烯炔类、三萜及甾体类、芳香苷类等化学成分［8］，其提取物中多糖类成分在降低血糖方面具有重要作用。段国峰等［9］研究发现，茅苍术多糖可降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖并提高胰岛素水平。黄柏可入肾、膀胱经，能清相火滋肾水，与苍术配伍，既能清热燥湿，又能从根源上防止湿邪新生。黄柏的化学成分包括多种生物碱，其中小檗碱是最主要成分［10］，小檗碱具有降血糖、降血脂、改善血流动力学、抗炎等多种作用，可通过改善肾脏肥大、肾小球硬化及萎缩、肾小球内血管阻力、系膜扩张、炎症浸润等多种途径改善DKD［11］。

通过构建苍术-黄柏药对治疗DKD 的网络图，从中筛选出排名前3 的药对，发现苍术-黄柏药对发挥主要作用的活性成分分别为槲皮素、汉黄芩素及β-谷甾醇。其中槲皮素是一种抗氧化剂黄酮醇，属于类黄酮组，研究发现槲皮素具有抗氧化及免疫调节等作用。DU 等［12］通过体内和体外研究，均发现槲皮素可通过激活Hippo 通路从而有效抑制肾小球系膜细胞增殖，改善肾功能。槲皮素还可通过激活AMPK 磷酸化和抑制肾脏中的固醇调节元件结合蛋白1c，减轻糖尿病肾病大鼠因脂质沉积引起的组织血脂异常，从而防止肾脏疾病进展［13］。汉黄芩素具有多种生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗过敏、抗凋亡等，汉黄芩素可通过抑制NF-kB 和TGF-β1/Smad3 信号通路的激活，对DKD 发挥抗炎、抗纤维化作用［14］。在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，汉黄芩素能明显抑制肾小管上皮细胞的坏死，并减少其凋亡，从而有效防止肾损伤和肾功能下降［15］。β-谷甾醇具有免疫调节、降血脂、抗氧化和抗糖尿病等多种药理作用，在植物中含量丰富［16］。

通过构建蛋白互作网络发现，苍术-黄柏药对治疗DKD的主要核心靶点为JUN、MMP9、CXCL8、TNF、VEGFA、PTGS2、AKT1、IL-6 等。JUN 是 由c-Jun、JunB 及JunD 构成的一整个家族蛋白体系，JUN 可以与Fos 家族蛋白组成稳定的二聚体AP-1，AP-1可以与某些调节细胞外基质（extracellular matrix，ECM）基因启动子的特定序列结合，从而调控ECM 成分的转录和表达［17］。肾小球系膜细胞增殖可导致ECM的过量产生和积累，而ECM的进行性积累是糖尿病肾病早期的重要特征，可导致肾小球硬化［18］。MMP-9 的激活与蛋白尿密切相关，白蛋白超载可以触发小管表达和分泌MMP-9，而MMP-9 的局部分泌增加可能通过促进肾小管基底膜的降解在肾病进展中发挥重要作用，导致糖尿病肾脏间质炎症和纤维化反应［19］。肾小球足细胞是VEGFA 的主要来源，VEGFA 具有肾脏保护作用，当其表达下降时易引起肾脏病变［20］。炎症反应可以加重肾脏损伤，IL-1b、IL-6 和TNF-α 等细胞因子被认为是炎症的主要调节因子，并在DKD 的发病机制中发挥关键作用［21］。CXCL8 是一种典型的CXC趋化因子，能通过与细胞表面G蛋白偶联受体（CXCR1和CXCR2）结合激活多个细胞内信号通路，促进中性粒细胞的生成和激活，加剧肾脏炎症反应［22］。

苍术-黄柏药对治疗DKD 主要涉及PI3K-Akt、TNF、Toll 样受体及HIF-1 等多条信号通路。PI3K/Akt 信号通路在细胞的生长、分化、增殖、凋亡及糖代谢等一系列活动中发挥着重要作用［23］，与DKD 足细胞凋亡［24］及自噬［25］均有密切关系。TNF 在各种免疫及炎症反应过程中发挥着重要作用，而TNF-α是TNF 家族体系中首个被发现的蛋白，最初发现由活跃的巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞产生，并参与全身炎症反应［26］，后在肾脏的多种细胞如内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小球和肾小管上皮细胞亦发现产生TNF-α。TNF-α可以刺激肾小球系膜细胞产生氧自由基，从而使过氧化脂质代谢产物增多，造成细胞内膜损伤，同时能刺激胶原的产生和成纤维细胞的增殖，加上糖基化胶原在血管壁的沉积，促使血管结构改变，最终导致DKD 等微血管病变［27］。TLR4是toll样受体家族蛋白中的重要成员，主要分布于中性粒细胞和单核巨噬细胞中，在DKD 的发生发展过程中起着重要作用，尤其是炎症反应。TLR4 在DKD 患者外周血中明显升高［28］，通过抑制TLR4/NF-κB 通路可以减少炎症反应、抑制细胞凋亡，减轻足细胞损伤［29］，减少肾纤维化程度［30］。慢性缺氧是包括DKD 在内的各种慢性肾脏疾病进展的重要因素，而缺氧诱导因子1（HIF-1）在缺氧造成的一系列病理机制中起着重要作用。肾脏组织缺氧状态下，HIF-1α 被激活，表达增加，一方面其可以通过HIF-1α/VEGF 通路促进新生血管生成，此外还可以上调EPO 基因表达，促进红细胞生成，使机体适应缺氧状态，减轻肾脏损伤［31］。

DKD 的发病机制目前尚不明确，遗传因素、糖脂代谢异常、炎性反应、氧化应激、免疫反应、自噬等均被认为是导致疾病发生发展的重要因素［32］，在肾脏病理表现上肾小球基底膜增厚、肾小球系膜扩张、肾小球结节样改变及小动脉玻璃样变等是DKD的特异性表现［33］。既往认为肾小球损伤是DKD的最早期表现，同时也是慢性肾脏病进展的罪魁祸首，而肾小管和间质损伤继肾小球损伤之后出现。近些年来，新的观点认为DKD在肾小球损伤出现之前即已出现肾小管的异常，且俱报道，肾小管萎缩和纤维化能更好预测慢性肾脏病的进展［34］。通过上述讨论可以得知，苍术-黄柏药对能发挥抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、调节免疫、抗纤维化等多种功效，对肾脏病理的调节涉及系膜细胞增殖、肾小球硬化、肾小管损伤、间质纤维化等多方面，无论是在DKD早期发病还是病程进展过程均可产生影响。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法探讨苍术-黄柏药对治疗DKD，发现其具有多成分、多靶点、多途径的特点，可以为进一步探讨中药药对治疗DKD 的作用机制提供依据。但本研究仍存在许多局限性，首先本研究是基于对各数据库内相关信息进行整合而成，其中可能存在数据库信息录用不全而造成本研究结果出现偏倚，其次，本研究结果缺乏实验验证，未来仍需进一步进行实验以验证其结果可靠性。